Способ выделения белка

Авторы патента:

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

C07K1/22 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ БЕЛКА, СВЯЗЫВАЮЩЕГО ТИРОКСИН, из сыворотки ретроплацентарной крови путем аффинной хроматографии с использованием в качестве сорбента эпоксисефарозной матрицы с присоединенным лигандом - тироксином, о т л и ч а ющ и и с я тем, что, с целью повышения выхода выделяемого белка и упрощения процесса, в качестве эпоксисефароз юй матрицы используют сефарозу , активированную эпихлоргидрином , а элюцию белка с сорбента осуществляют щелочью при рН 9,3-12. «

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (!9! SU ((I!

217 А

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: д

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

Н ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3236750/28-13 (22) 09.01.81 (46) 30 . 07 . 86. Бюл. N 28 (71) Институт биоорганической химии

АН Белорусской CCP (72) А.А.Ахрем, М.Н.Ермоленко, В.В.Котусов,: О.А.Стрельченок и В.Л,Чащин (53) 543.9 (088.8) (56) 1.Kagedal В.,Kallberg M. An improved procedure for the isolation

of thiroxine-binding globulin from

human pregnancy serum. Clin. Chim.

Acta, 1977, v. 78, р. 103-111.

2.Petek W. Nachweis einer typenspezifischen Mikrogetегоgeni tat des

humanen Thiroxin-bindenden Globulins

durch isoelektrische Fokussirung.Л, Clin. CHEM.Clin.Biochem., 1979, v. 17. (5D 4 С 07 К 7/00 G 01 N 33 50 (54) (57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКА, СВЯЗЫВАЮЩЕГО ТИРОКСИН, из сыворотки ретроплацентарной крови путем аффинной хроматографии с использованием в качестве сорбента эпоксисефарозной матрицы с присоединенным лигандом вЂ” тироксином, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повьппения выхода выделяемого белка и упрощения процесса, в качестве эпоксисефарозной матрицы используют сефарозу, активированную эпихлоргидрином, а элюцию белка с сорбента осуществляют щелочью при рН 9,3-12.

Ф 9328

Изобретение относится к области биохимии и медицины, конкретно к выделению белка, связывающего тироксин, который может быть использован в качестве ингредиента радиодиагнос-, тических наборов для определения . тироксина.

Известен способ выделения белка, связывающего тироксин, заключающийся в обработке разбавленной водой в со- 10 отношении 2:1 сыворотки ретроплацентарной крови гидроксиапатитом, центрифугировании и аффинной хроматографии супернатанта на сорбенте, представляющем собой сефарозу, активи- !5 рованную 1,4-бис(2,3-эпоксипропокси)бутаном (эпоксиактивированная сефароза) с присоединенным лигандом вЂ” тироксином с последующей элюцией 2шМ 8-анилинонафталиносульфо- 20 кислотой (АНЯ). Иэ литра сыворотки получено 13-15 мг белка, связывающего тироксин, что составляет 22

24 (13

Недостатками способа являются низкий выход белка, связывающего тироксин, и необходимость обработки сыворотки гидроксиапатитом, что усложняет процедуру выделения.

Целью изобретения является новы- 30 шение выхода белка, связывающего тироксин, а также упрощение процесса. Поставленная цель достигается тем, что в качестве эпоксисефарозной матрицы используют сефарозу, активированную эпихлоргидрином, а элюцию белка с сорбента осуществляют щелочью при рН 9,3-12.

Используемый сорбент вследствие своей структуры обеспечивает более селективное извлечение выделяемого белка и, как следствие, более высокий выход.

В сорбенте, используемом в способе вЂ” прототипе более длинная по сравнению с предложенным сорбентом гидрофобная "ножка", соединяющая лиганд с матрицей вЂ” остаток 1,4-бис(2,3-эпоксипропокси)бутана. Это оказывает существенное влияние на процесс сорбции. За счет гидрофобных взаимодействий возможна сорбция других белков, которые загрязняют аф.вЂ” финный элюат, что препятствует сорбции тироксин-связывающего белка и снижает его выход.

Соотношение объемов сыворотки крови и аффинного сорбента при опреде17 2 ленной концентрации конъюгированного тироксина подбирается эмпирически.

Оптимальная концентрация иммобилизованного тироксина в полученной сус-ю -4 пензии 5 ° 10 вЂ” 1 -10 мол/л. Влияние объема аффинного сорбента при постоянном объеме сыворотки крови (1 л) на выход целевого продукта приведено в таблице. !

Элюция целевого продукта щелочью по сравнению. с элюцией 8-анилинонафталиносульфокислотой позволяет получить свободный от лиганда белок, тогда как при элюции 8-анилинонафталиносульфокислотой необходима очистка целевого продукта от элюента.

Указанный интервал значений рН при элюции определяется, с одной стороны, точкой ионизации гидроксильной группы тироксина, а с другой вЂ” возможностью инактивации белка в сильнощелочной среде.

Пример 1. Синтез аффинного. сорбента.

100 мл сефарозы 4В (Pharmacia

Рые chemicals, Швеция) промывают на фильтре 1 л 0,5 М NaCl и 1 л воды.

К влажному гелю прибавляют 80 мл 1 М

Na0H.è 10 мл эпихлоргидрина. Смесь перемешивают 2.ч при температуре

37 С. Избыток реагентов отмывают последовательно водой (4 л) и О,1 М

NaHC0» рН 8,6 (1 л) . В результате реакции получают матрицу с 30 мкмол эпоксигрупп на 1 мл геля. Затем

200 мг тироксина растворяют в 10 мл

1 М ИаОН, перемешивают 4 ч при комнатной температуре и оставляют на ночь при 2-8 С. По окончании реакции аффинный сорбент промывают 0,1 М

НаНСО> .рН 8,6 (4 л). Полученный сорбент, содержащий 2,4 мкмол иммобилизованного тироксина 1 мл геля, разбавляют сефарозой 4В до концентрации тироксина 1 мкмол на 1 мл геля. Концентрацию иммобилизованного тироксина определяют согласно (2).

Пример . 2. Получение белка, связывающего тироксин.

1 л сыворотки ретроплацентарной крови перемешивают в течение ночи о при температуре 4 С со 100 мл аффинного сорбента, содержащего 1 мкмол конъюгированного ти1 оксина на 1 мл геля, что создает концентрацию тироксина во всем объеме суспензии

1 10 мол. Аффинный сорбент отделяют путем фирьтрования суспензии на по932817

5 3

120

Редактор О.Филиппова Техред. JI.Îëåéíêê .

Корректор В.Бутяга

Заказ 4147/3 Тираж 343

ВНИИПИ Государственного комитета СССР. по делам изобретений и открытий

113035 Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, г..ужгород, ул. Проектная, 4

3 ристом фильтре и промывают 1,5 л

0,1 M NaHC01, рН 9,0. Гель переносят на колонку с пористым стеклянным фильтром и продолжают отмывку до получения элюата с постоянной оптической плотностью при 280 нм.Злюцию целевого продукта осуществляют при комнатной температуре 0,001 M NaOH, ; рИ 11,0. Скорость элюции 3 мл/мин. Количество белка, связывающего тироксин в элюате составляет 45 мг или 90X.

Выход целевого продукта в зависимости от количества аффинного сорбента (на 1 л сыворотки) Технико-экономическая .эффективность изобретения состоит в повьппе10 нии выхода белка, связывающего тиро- ксин. Способ гарантирует одностадийное, практически количественное, выделение из сыворотки ретроплацентарной крови белка, связывающего тиро15 ксин. Воспроизводимость способа практически количественный выход белка, связывающего тироксин, низкая стоимость и доступность сырья делает возможным наладить опытно-промышлен20 ный выпуск диагностических наборов для определения тироксина, основным компонентом которых является белок, связывающий тироксин.