Способ получения адсорбентов,содержащих аминогруппы
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДСОРБЕНТОВ , СОДЕРЖАЩИХ АМИНОГРУППЫ, ковалентным присоединением лигандов к активированным твердым носителям с последу|Ющей химической модификацией иммоби1лиэонанного лиганда, отлкчаю:щ и и с я тем, что, с целью упрощения процесса и исключения неспецифических эффектов при хроматографии биополимеров на указанных адсорбентах , в качестве лигандов используют гидраэиды К-эамеценных аминокислот или пептидов, .а последующую химическую модификацию осуществляют обработкой носителя 3,9-4,1 М раствором хлористого водорода в диоксане или эквимолярной смесью трифторуксусной кислоты и хлористого метилена.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
„„SU„„1054353 А
3(59 С 08 В 37/12; В 01 J 20/30;
С 12,Н 11/00
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ
g4.*..
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ / " -:..;."„." ;, К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
j (21) 3431489/23-05 (22) 12.03.82 (46) 15.11.83. Бюл. 9 42 (72) Б.A. Клящицкий и В.Х. Митина (71) Институт биологической и меди- цинской химии АМН СССР (53) 678.83(088.8) (56) 1. Cuatrecasas P. Protein purification by affinity chromatography (Derivatization of agarose and polyacrylamide bead.s). - "J, Biol, Chem,"
1970, ч.245. с. 3059-3065.
2. Deutsch D,G., Markz: Е,Т. Plasminogen:purification from human plasma by affinity chromatography.
"Science", 1970, т. 170, с.1095-1096.
3. Vilchek М,, И1гоп Т. Stable
high capacity and non charged agaroве. derivatives for immobilization of .
biologically active compounds апй for affinity chromatography; — Mo1, and Cell, Biochem„ 1974 т. 4, с. 181-187 (п зототип). (54 ) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДСОРБЕН»
ТОВ, СОДЕРЖАЩИХ АМИНОГРУППЫ, ковалентньм присоединением лигандов к активиpoBaHHbM твердьач носителям с последу;ющей химической модификацией иммоби,лиэованного лиганда, о т л и ч а ю,.шийся тем, что, с целью упрощения процесса и исключения неспецифических эффектов при хроматографии биополимеров на укаэанных адсорбентах, в качестве лигандов используют гидраэиды И-замещенных аминокислот или пептидов, .а последующую химическую модификацию осуществляют обработкой носителя 3,9-4,1 М раствором хлористого водорода в диоксане или эквимолярной смесью трифторуксусной Я кислоты и хлористого метилена.
1054353
Изобретение относится в способам получения адсорбентов, содержащих аминогруппы, и может быть использовано при очистке 6иополиме ров (например белков ) глетодами гидрофобной или аффинной хроматографии. 5
Известен способ получения адсорбентов, содержащих аминогруппы, путем присоединения лигандов (aC,ur-диаминоалканов ) к активированным твердым носителям (Br СИ-активированной 10 агарозе) I 1).
К недостаткам способа относится возникновение положительно заряженной изомоченинной группы в месте присоединения лиганда к носителю и необ- 5 ходимость использования эначительноГо избытка диаминоалкана для предотвращения поперечного связывания шариков агарозы.
Известен также способ получения адсорбентов, содержащих аминогруппы, ковалентним присоединением лигандов
К активированным твердым носителям (иммобилизацией лизина íà BrCN-активированной агароэе ) (2 3.
Однако этот способ вызывает появление на адсорбенте не только дополнительных положительно заряженных групп в месте присоединения лизина к носителю, но и карбоксильных групп, что может придавать адсорбенту нежелательные ионообменные свойства.
Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и результатам является способ получения адсорбеитов, содержащих аминогрунпы, кова-Зз лентным присоединением лигандов (ди гидразидов двухосновных кислот ) к, активированныи твердим носителям (ВтCN-активированной анарозе) с последующей химической модификацией иммобилизованного лиганда (сукцинилирование и присоединение с, о-диаминоалканов с помощью карбодиимидов). Полученные адсорбенты при физиологических значениях рН не содержат заряженных групп в месте присоединения лиганда к носителю 63 3.
Однако этот способ отличается многостадийностью и необходимостью использования большого избытка дигидраэидов и дефицитных карбодиимидов ° Кроме того, полученные адсорбенты могут содержать непрореагировавшие с диаминоалканом карбоксильные группы, что приводит к появлению дополнительных заряженных групп5 и наличию неспецифических эффектов при хроматографии биополимеров.
Цель изобретения — упрощение проесса и исключение неспецифических эффектов при хроматографии биополи- 60 меров на указанных адсорбентах.
Укаэанная цель достигается тем, что согласно способу получения адсорбентов, содержащих аминогруппы, ковалентным присоединением лигандов к активированным твердым носителям с последующей химической модификацией иммобилизованного лиганда в качестве литандов используют гидразиды N-эамещенных аминокислот или пептидов, а последующую химическую модификацию осуществляют обработкой носителя 3,9-4,1 М раствором хлористого водорода в диоксане или эквимолярной смесью трифторуксусной кислоты и хлористого метилена.
Использование предлагаемого способа получения адсорбентов, содержащих аминогруппы, позволяет получать адсорбенты,не имеющие дополнительных заряженных групп, что исключает нежелательные ионообменные эффекты при последующей хроматографии. Полученные адсорбенты могут быть использованы для очистки биополимеров, например, протеолитических ферментов, моно- и диаминоксидаз. В последнем "лучае в качестве лиганда целесообразно использовать производные лизина, что приводит к адсорбенту с иммобилизованным 1,5-диаминопентаном — биоспецифическим лигандом для диаминоксидазы. Кроме того, при использовании производных лизина существенно увеличивается удельное содержание аминогрупп на адсорбенте.
Адсорбенты,полученные по предлагаемому способу, могут служить в качестве исходного материала для последующего присоединения биоспецифических лигандов различной химической природы по аминогруппам иммобилиэованных аминокислот или пептидов. В последнем случае открывается возможность получения высокоэффективных аффинных адсорбентов с незаря>кенньми гидрофильными пептидньв и вставками.
В качестве носителей могут быть использованы различные твердые носители, устойчивые в условиях удаления N-защитных групп, такие как
СL-сефароэа, полиакриламидные носители, шарики из пористого стекла и другие. В качестве лигандов применяют гидразиды N-замещенных eL-, м —, диаминокислот и т.д, Предлагаемый способ позволяет использовать в качестве защитных групп лиганда третбутилоксикарбоыильную, тритильную, трифторацетильную и другие защитные группы, удаление которых можно осуществить в условиях, не разрушающих адсорбент, Пример 1. Получение адСорбента L-лизин-гидразид-CL-сефароэа.
Суспензию 10 мл BrCN-активированной CL-сефароэы в 10 мл 0,1 И раствора NaHCO, рН 0,0,перемешивают
20 ч при 4ОС с 50 мг (0,1 ммоль)
lal гидра зида N, N -ди-трет-бутилоксикарбонил (БОК)-Ь-лизина, промывают
1054353 муле (мкэкв/г вл.веса)=
Количество ИН -групп
4,65 A 420 нм количество сефарозы r вл.веса/100 мл суспензии
Условия снятия БОК-защитных групп
Оптимальное время гидролиэа
Максимальное коли- З5 чество группг мкэкв/г вл. веса
85%-ная НСоОн 23
1,5
85%-ная НСОон-СН2С1 (1:1)
СР зСООН-СН2С12 (1:1) 1,2
3,9
CF@COOH-CHgClg (1:2) 4,2
4 М НС1 в диоксане 3
5,4
0,5
Ог1 М НС1 в АсОН 23
65
100 мл 0,1 I(ЫаНСоз, водой, затем
50 мл смеси уксусная кислота - вода (1:1) и окончательно водой. Полученный гель смешивают с 10 мл 1 М этаноламина, рН 9,0,перемешивают о
2 ч при 20 С и промывают водой °
Согласно данным потенциометрического титрования адсорбент не содержит положительно заряженных групп при физиологических значениях рН.
10 мл адсорбента (N+, If -ди-БОК-L-лизин гидразид-CL-сефароза ) промывают 200 мл ацетона, затем
100 мл хлористого метилена (или диоксана),обрабатывают 5 ч при
40С 10 мл смеси трифторуксусной кислоты и хлористого ь тилена или о
3 ч при 4 С диоксаном, насыщенньм
НС1 (4М), затем промывают хлористым метиленом (или диоксаном), спиртом, водньм спиртом и окончательно водой.
Результаты использования различных условий снятия БОК-защитных групп приведены в таблице.
Адсбрбент Б-лизин-гидразид-СЬ-сефароза хранят в воде в присутствии 0,023 аэида натрия при 4 С.
П р и м ер 2. Получение адсорбента L-лизин-гидраэидглутаральдегид-биогель P-300 °
Перемешивают 20 мл биогеля P-300 с 100 мл 6%-ного раствора глутарового альдегида в 0,1 М калий-фосфатном буферном растворе, рН 7, О, в течение 17 ч при 37 С, гель промывают водой, смешивают с раствором 60 мг
Определение содержания лиганда в полученном адсорбенте проводят спектрофотометрическим глетодом в геле — по поглощению в УФ-свете суспензии ринитрофенилированных производных аминосодержащих адсорбентов в 0,1%-ном растворе =-гарозы.
Аликвоту адсорбента перемешивают 2 ч при 37 С с 1,,5 мл 0,1Ъ-ного водного раствора тринитробенэолсульфокислоты, содержащего 0,1Ъ NaHSO3, в 3 мл 2 М калий-боратного буферного раствора, рН 9,2, фильтруют, гель тщательно промывают водой, вы)5 держивают на пористом фильтре в течение 3 мин в вакууме водоструйного насоса, Навеску полученного тринитрофенилированного производного сефарозы (0,15 — 0,9 r влажного веса) переносят в кювету, содержащую 1,5 мл
0,1 Ъ-ного раствора агарозы в 1,5 мл
1М калийборатного буферного раствора и измеряют поглощение суспензии при 240 н г;;ротив аналогичной суспензии незамещенной сефарозы. Количество НН -групп определяют по форгидраэида If,If -ди-БОК-L-лизина в
30 мл 0,1 II калий-фосфатного буферного раствора, рН 7,0, перемешивают
2 ч при 4 С, промывают водой, затем
50 мл 0,1 N раствора НС1 и водой, 20 мл полученного адсорбента про мывают 200 мл ацетона, 100 мл хлористого метилена, затем смешивают с 20 мл смеси трифторуксусной кисло ты.и хлористого метилена и перемешивают 16 ч при 4 С, затем промывают хлористым метиленом, спиртом, водным спиртом и окончательно водой.
Адсорбент L-лизин-гидраэид-глутаральдегидбиогель P-300 по данньы спектрофотометрического анализа в геле содержит 1,3(мкмоль 1,-лизина на 1 r влажного веса.
Пример 3. Получение адсорбента аминокапроилгидразид-CL-сефароэа.
Суспензию 10 ип Br CN-активированной CL-сефарозы в 10 гоп О, 1 N раствора
NaHC03,рН 8,0, перемешивают 16 чпри
4 Сс раствором100 мг (0,2 ммоль) оксалата гидразида N-тритил-E-аминокапроновой кислоты в 10 мл воды, промывают 100 мл 50%-ного диметилформамида, 100 ил воды. Полученный гель смешивают с 10 мл 1М этаноламина, 4
1054353
Составитель И. Стояченко
Редактор Н. Киштулинец Техред О.Неце Корректор Г. Orap
Заказ 9031/30 Тираж 494 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 рН 9,0, перемешивают 2 ч при 20 С и промывают водой.
10 мл полученного адсорбента промывают 200 мл ацетона, затем 100 мл диоксана, обрабатывают 2 ч (4 С) 4 М раствором хлористого водорода в диск- сане, промывают диоксаном, спиртом, водными спиртами и окончательно водой.
Адсорбент по данным спектрофотометрического анализа в геле содержит
1,7 мкэкв NH2- n Ha 1 r влажного веса.
Таким образом, предлагаемый споСоб является более простьм, чем известный, н исключает неспецифические эффекты при хроматографии биополи- 15 меров на полученных сорбентах.
Предлагаемый способ также позволяет повысить удельное содержание аминогрупп на адсорбенте (так, в случае использования N,N-защищенных () производных гидразида лизина количество аминогрупп на моль иммобилиованного лиганда увеличивается вдвое о сравнению с «3 g или лигандами, содержащими 1 аминогруппу) . Увеличе- 25 ние концентрации аминогрупп позволяет при дальнейшем присоединении биоспецифического лиганда существенно повысить концентрацию последнего на адсорбенте, что в ряде случаев может оказать положительный эффект на последующую хроматографическую очистку биополимеров.
Предлагаемый способ исключает также наличие Гидрофобных групп на адсорбенте по сравнению с (.3 3, что также исключает неспецифические эффекты при хроматографии биополимеров, Базовым объектом можно считать аминогексилсефарозу (AH-Берла.гose)— продукт шведской фирмы Pharmacie Fine
Сhemiса1s, который широко используется в исследовательской работе.
Указанный коммерческий продукт производится иммобилизацией гексаметилендиамина на BrCN-активированной сефарозе. Он содержит дополнительную положительно заряженную группу в месте присоединения лиганда к носителю, а также гидрофобную гексаметиленовую углеводородную цепочку.
Предлагаемые адсорбенты не содержат гидрофобных и дополнительных заряженных групп.
