Способ определения пиридоксаля или пиридоксаль-5-фосфата

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПИРИДОКСАЛЯ ИЛИ ПИРИДО1ССАЛЬ-5-ФОСФАТА путем обработки анализируемой пробы химическим реагентом с последующим измерением интенсивности Флу есценции полученного соединения, о т л и ч а ю щи и с я тем, что, с целью упрощения способа, в качестве химического реагента используют о-метилгидроксиламин , обработку проводят при рН 4-5, а измерение интенсивности флуоресценции проводят при рН 6-7.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) SU (и) Ц50 G 01 N 21/64

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЙ

Ф .: 7

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTI44 к авто скому свйдкткпьСтау (21) 3446827/23-04 (22) 01.06.82 (46) .15.11.83. Бюл. 9 42 (72) H.П.Бахулина; Л.A.Полякова, Е.В.Горяченкова, 10.В.Морозов, P.È.Õoìóòoâ, Ю.М.Залесская и М.A.Крашенннннкова (71) Институт молекулярной биологии AH СССР и Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза (53) 543.432(088.8) (56) 1. Bain Х.A. Williams Н.Ь.

Inhibition in the nervous System and

gamma-aminobutyric Acid. New аког)с.

1970, р. 275.

2. Haskell В.Е. Snell E.Е. An

Improveol Apotryptophanase Assay for

Pyridoxal Phosphate. Anal. Biochem, 45, 1972, р ° 567 °

3. Chanhan И.S., Dakshinamurti K., Fluorometric Assay of Pyridoxal and

Pyridoxal-5-Phosphate. Anal. Biochem.

96, 1979, р. 426 (прототип). (54)(57) СПОСОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПИРИДОК-1

САЛЯ ИЛИ ПИРИДОКСАЛЬ-5 ФОСФАТА путем обработки анализируемой пробы химическим реагентом с последую@им измерением интенсивности 4луоресценцнн полученного соединения, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве химического реагента используют о-метилгидроксиламин, обработку проводят при рН

4-5, а измерение интенсивности флуоресценции проводят при рН 6-7.

1,1054750 2

Составитель В,Шкилькова

Редактор С.Тимохин Техред С.Легеза, Корректор В.Бутяга

Заказ 9095/50 Тираж 873 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Х(-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r.Óæãîðîä, ул.Проектная, 4

Изобретение относится к аналитической биохимии и может быть исполь" эовано в энзимологни и медицине.

Пиридоксаль-5-фосфат (ПЛФ), кофермент многих ферментов азотистого обмена, является фосфорилированным производным соединения группы витамина В6 °

Известен высокочувствительный микробиологический метод, который основан на использовании штампов мик-10 роорганизмов, нуждающихся для роста в соединениях группы витамина ВБ (1).

Однако этот метод не обладает достаточной селективностью, Известно знзиматическое определение ПЛФ с использованием различных апо-ферментов (2).

Однако такой метод позволяет определять только ПЛФ и не пригоден для определения пиридоксаля (ПЛ). 29

Наиболее близким к предлагаемому способу по технической сущности и достигаемому результату является флуоренсцентный метод анализа ПЛ и

ПЛФ, основанный на получении их ант" 75 ранилатных производных. Для этого анализируемую пробу обрабатывают метилантранилатом в абсолютном метаноле, затем восстановителем, цодкисляют НС1 в метаноле, упаривают в gp вакууме растворяют в воде, подкисля" ют, нейтрализуют, экстрагируют мети-. ленхлоридом, выделяют чистые,антра- . нилатные производные методом тонкослойной хроматографии и проводят их анализ флуоресцентным методом (3).

Известный способ .позволяет определить ПЛ и ПЛФ в растворах в коли" чествах до 1 нг/мл (концентрация

4 ° 109М).

Недостатком этого способа является его многостадийность и сложность.

Целью изобретения является упрощение способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу, заключающемуся 45 в обработке анализируемой пробы 0-метилгидроксиламином при рН 4-5 с последующим измерением интенсивности флуоресценции полученного соединения, при рН 6- 7 в качестве химического ре- 50 агента используют О-мвтилгидроксиламин обработку проводят при рН 4-5, а измерение интенсивности флуоресцен ции — при рН 6-7 °

Для осуществления флуоресцентного анализа предварительно строят калибровочный график. Для этого в кювету, содержащую 2,9 мл раствора ПЛ или

ПЛФ в 0,1 М Na-ацетатном буфере рН

5,0 при заданной концентрации (концентрации варьируют в пределах

10 -10)М), добавляют 0,1 мл 0,3 h1 раствора хлоргидрата 0-метилгидроксиламина в том же буфере. Реакцию проводят в темноте при 25 С. Спустя

30-40 мин доводят рН раствора до

6-7 и измеряют интенсивность флуоресценции при 450 нм и длине волны возбуждающего света, равной 370 нм.

Полученные данные используют для построения калибровочного графика, Пример. Анализируемую пробу растворяю в. 2,9 мл 0,1 М Na-ацетатного буфера рН 5,0, добавляют 0,1 мл

0,3 М раствора хлорида О-метилгидроксиламина в 0,1 М Na-ацетатном буфере рН 5,0. Реакцию проводят в тем- ноте при 25ОС. Спустя 30-40 мин доводят рН раствора до 6-7 и измеряют интенсивность флуоресценции при

450 им и длине волны возбуждающего света 370 нм. Концентрацию ПЛ или

ПЛФ определяют по калибровочному графику, вводят коррекцию на разведение исходного растовра.

Таким образом, предлагаемый способ значительно проще и осуществляется быстрее известного способа, требует небольшое количество реакти вов и позволяет проводить флуоресцентное определение образовавшихся

О-алкилоксимов ПЛ и ПЛФ непосредственно в реакционной смеси без предварительного выделения.

Преимуществом предлагаемого способа является гладкое протекание реакции образования оксимов в водных растворах, что существенно, поскаль" ку при биохимических и медико-биологических исследованиях содержащее ПЛ и ПЛФ приходится определять именно в водных средах.

Чувствительность предлагаемого способа составляет для ПЛФ 1 ° 10 М, а для ПЛ - 4 10-(0М при соотно нии сигнала к шуму равном 8:l.