Проточный цитофлуориметр

 

ПРОТОЧНЫЙ .ЦИТОФЛУОРИМЕТР, содержащий флугоресцентный микроскоп , форсунку для подачи и гидродинамической фокусировки жидкости с исследуемыми клетками, покровное стекло микроскопа, систему для отвода жидкости с клетками, отличающийся тем, что, с целью .повышения точности и .производительности измерений, форсунка размеще на no;q покровньм стеклом, а система отвода жидкости с клетками выполнена в виде полости смачивающегося материала, прикрепленной к нижней поверхности покровного стек ,ла под объективом микроскопа, прир чем для обеспечения стационарного потока жидкости с клетками расстоя- |//% ние от края пятна жидкости на покров-||/| ном стекле до места прикрепления полости составляет величину 0,5 1 ,0 от ширины пятна.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУЬЛИК (IQ) SU Qf)(щп Q 01 и 21 64 А 61 В 10 00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

IlP ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3388006/18-25 (22) 25.01.82 (46) 23 11 83е Бюл М 43 (72) A,É.третьяков, И.Я.Барский, В.В.Венин, Г.В.Папаян,Ю.M.Pîýàíîå и С..И.Степанов (53) 535 37 (088е8) (56) 1. Gohde W. Automation of cytogluorometry by use ofthe impulsmicrophotometer,-,"Fluorescence

techniques in cell biology" Springer verlag Berlin - techniques in cell biology.

2. Gray J,W. et а11 Slit Scau

flow cytometry of mamma1iari chroаовошев.J Histochem and Cytochem,.

I979, V,27 9 1i рр. 441-444, З.Lindmo T and Steen Н.В. Characteristics of à simple high - resolution Ыом cytometer based on a

new flow configuration. Biophys

1979, Ч 28, 9 1; рр. 33-. 34 (прототип) .

Г54) (57) OPOTO×ÍÛß ЦИТОФЛУОРИИЕТР, содержащий флуоресцентный микроскоп, форсунку для подачи и гидро динамической фокусировки жидкости с исследуеьвми клетками, покровное стекло микроскопа, систему для отвода жидкости с клетками, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью .повышения точности и,производительности измерений, форсунка размещена под покровным стеклом, а система отвода жидкости с клетками выполнена в виде полости смачиваю- щегося материала, прикрепленной к нижней поверхности покровного стек.ла под объективом. микроскопа, причем для обеспечения стационарного потока жидкости с клетками расстояние от края пятна жидкости на покров ном стекле до места прикрепления полости составляет величину 0,51,0 от ширины пятна.

1056008

Изобретение относится к технической физике, а именно к аналитической микроскопии, s частности к приборам для биологии и медицины, и наиболее эффективно может быть использовано для скоростного автоматического анализа содержания. клеточных компонентов и изу-чения их физико-химического состояния путем измерения флуоресцент- ных характеристик большого числа отдельных клеток.

Известен проточный цитофлуориметр на базе флуоресцентного мик. роскопа, предназначенный для автоматической регистрации флуорес- 15 центных параметров отдельных клеток в составе. клеточной суспензии со скоростью измерения .до нескольких тысяч клеток в секунду. В этом приборе взвесь исследуемых клеток пос- 20 тупает из капилляра в проточную камеру, расположенную на предметном столике микроскопа и проходит с током жидкости в горизонтальном направлении с большой скоростью через поле зрения микрообъектина В момент прохождения клетки перед микрообъективом, сфокусированном на определенную плоскость, осуществляется освещение клетки возбуждающими лучами от источника света1 на выходе датчика излучения фотометрической насадки формируется импульс, амплитуда которого пропорциональна интенсив.ности флуоресценции. Система регистрации проводит анализ амплитудного . распределения импульсов и выдает гистограмму распределения клеток ,по интенсивности их свечения. Стаби,лизация положения горизонтального потока клеток при их прохождении 40 в поле зрения объектива осуцествляется с помощью гидродинамической фо. кусировки: в камере под давлением создается горизонтальный ток жидкости, в центре которого распола- 45 гается капилляр с исследуемыми клетками (1J и (21..

Недостатком указанного прибора является малая стабильность положения клеток относительно объектива, в результате чего клетки выходят эа пределы глубины резкости микрообъектива, что приводит к уменьшению точности измерения. Другим недостатком прибора является невозможность использования в нем высокоапертурных иммерсионных объективов, имеюцих обычно малое рабочее состояние, не позволяющее сфокусироваться на измеряемые клетки через стенку ка- 60 меры и слой жидкости, находящийся, перед клетками.

Наиболее близким по техничес1 кой суцности к предлагаемому является проточный цитофлуориметр, со» g5 держащий флуоресцентный микроскоп, форсунку для подачи и гидродинамичной фокусиронки жидкости с иссле« дуемыми клетками, покровное стекло микроскопа, систему для отвода жид-. кости с клетками. В этом устройстве стабильный горизонтальный поток клеток н плоскости фокусиронки инвертированного микроскопа.обеспечивается гидродинамической фокусировкой клеток н струе жидкости, падающей. под углом на верхнюю поверхность покровного стекла и собираемой с него с помощью отсасывающего насоса (3) .

Недостатком этой конструкции прибора является невозможность использования в нем обычных (неиннертированных ) флуоресцентных микроскопов, которые н частности комплектуются светосильными высокоапертурными иммерсионными микрообъектинамй, необходимыми для точных флуориметрических измерений.. Другим недос-. татком известной конструкции является необходимость использования н ней принудительного (с помощью насоса) отвода жидкости с клетками со дна,камеры, что усложняет конструкцию камеры и понижает надежность и точность измерения и удобства ее . эксплуатации.

Целью изобретения является повышение точности и производительности измерений.

Для достижения цели в проточном цитофлуориметре, содержащем флуоресцентный микроскоп, форсунку для подачи и гидродинамической фокусировки жидкости с исследуемыми клетками, покровное стекло микроскопа,. систему для отвода жидкости с клетками, форсунка размецена под покронным стеклом, а система отвода жидкости с клетками выполнена в виде полости смачиваюцего материала, прикрепленной к нижней поверхности .покровного стекла под объективом микpomona причем для обеспечения стационарного потока жидкости с клетками расстояние от края пятна жидкости на покронном стекле до места прикрепления полости составляет величину 0,5-1,0 от ширины пятна.

На чертеже показана принципиальная схема проточного цитофлуориметра.

Проточная камера состоит из корпуса 1 и размещенной в ней форсунки 2. Вдоль осй форсунки расположен капилляр 3, по которому подается суспензия клеток. Корпус форсунки имеет патрубок 4 для подачи воды в форсунку. На корпусе камеры закрепляется покровное стекло 5. Полоска смачивающегося материала 6 закрепляется в верхней части корпуса камеры и касается нижней поверхности

1056008

10 l5

45 покровного стекла. В нижней части корпуса камеры имеется патрубок 7 для стока воды. Проточная камера крепится на предметном столике 8 флуоресцентного микроскопа. Функциональная схема проточного цитофлуориметра включает- микрообъектив 9, источник 10 света, коллектор 11, полевую диафрагму 12, светофильтры 13 для выделения возбуждающего света, светофильтр 14 для выделения света флуоресценции, интерференционную светоделительную пластинку 15, фотоэлектронный умножитель 16, спектрометрический усилитель 17, многоканальный анализатор

18 импульсов ° .

Проточный цитофлуориметр работает следующим образом.

Суспензия клеток, предварительно меченых флуоресцирующим краси.телем, подается с постоянной скоростью в центральный капилляр 3 форсунки 2. Одновременно через пат» рубок 4 в форсунку под давлением

0,6-0,8 атм поступает вода, которая обтекает центральный капилляр 3, при этом за счет гидродинамической фокусировки клетки в суспензии выстраиваются вдоль оси форсунки. Таким образом, формируется ламинарная коаксиальная струя диаметром 150 мкм, вдоль.оси которой выстраиваются клетки суспензии. Эта струя, несущая клетки, направляется снизу вверх под углом 60-70она нижнюю поверхность покровного стекла 5.

В месте падения на покровное стекло струя распюцощивается и образует пятно эллипсовидной формы, длина и ширина которого зависят от внутреннего диаметра форсунки, :угла падения струи на покровное стекло и давления подачи жидкости, На определенном расстоянии от края пятна по току жидкости .(0,5-1,10 от ширины пятна) прикрепляется полоса смачивающегося материала 6, с помощью которой жидкость с клетками самотоком стекает с покровного стекла на дно камеры и затем через патрубок.7 удаляется из нее. Расстояние, на котором прикрепляется полоска 6, достаточно для того, чтобы было исключено возникновение значительной турбулентности при ударе . жидкости о полоску, и в то же время это расстояние не слишком велико, иначе на нижней поверхности покровного стекла до полоски будет

1равномерный ток жидкости. Для обеспечения стационарного потока жидкости расстояние от края пятна жидкости на покровном стекле до места прикрепления полоски должно составлять величину 0,5-1,0 от ширины пятна, что при диаметре выходного отверстия форсунки 150 мкм, угле падения жидкости на покровное стекло 60-70 и давлении подачи жидкости

0,6-0.,8 атм соответствует 1-2 мм и общему расстоянию от места цадения струи до места прикрепления полоски смачивающего материала 3-4 вам. При этом в поле зрения микрообъектива

9 формируется стабильный поток клеток. Во время нахождения клетки в после зрения объектива возбуждается флуоресценция красителя, связанного с определенным внутриклеточным веществом (например, ДИК, белком).

Источником возбуждающего флуоресценцию света является ртутная лампа 10.

Свет от нее собирается коллектором 11 и при помощи интерференционной светоделительной пластинки 15 направляется через микрообъектив 9 на исследуемые клетки. Светофильтры 13 и

14 выделяют полосы возбуждения и флуоресценции соответственно. Фотоэлект ронный умножитель 16 преорразует световые сигналы свечения клеток, пересекающих поле зрения микроско-,. па, в электрические, которые затем усиливаются с помощью спектрометрического усилителя 17 и поступают на вход многоканального амплитудного анализатора 18. В результате амплитудного анализа получается гистограмма распределения измеряемого в клетках вещества.

Таким образом, предлагаемое устройство может быть установлено на, предметном столике любого серийного флуоресцентного микроскопа, превращая ego при соответствующей комплектации промыапенности электронными блоками в прибор для скоростного автоматического анализа свойств клеток. Кроме того, это устройст50 во проще известного по кбнструкции и в изготовлении, так как насос, применяемый в известном устройстве для отвода жидкости с клетками, заменен полоской смачивающегося материала, благодаря чему сбор скопившейся на покровиом стекле жидкости с клетками осуществляется самотоком.

1056008

Составитель Н ° Зоров

Редактор Н,Лазаренко Техред Л.Пилипенко

° (Ю»

Корректор АеТЯско

° В ФВФ» ЮЮ М

Заказ 92,89/33 Тираж 873 . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035 Москвар Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5

Филиал ППП "Патент",, г. ужгород, ул. Проектная, 4