Способ получения реагента для иммунохимического анализа

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕН1М РЕАГЕНТА ДЛЯ ИММУНОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА путем взаимодействия гаптенового органического соединения с веиеством-детектором икмунохимической реакции, о т л и ч. а ю ш и и с я тем, что, с целью повышения чувствительности реагента, в качестве вещества-детектора используют N -{6-аминогексил)-ацетамидное производное никотинамидадениндинуклеотида или N

(191 (11)

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

ХО

РЕСПУБЛИК

)(51) а 0 N 33 50

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И (ЛНРЫТИЙ (21 ) 3006 50 8/2 8-.1 3 (25) 3006509/28-13 (22) 14.11.80 (46) 15.01.84. Бюл. Р 2 (72) И.В. Березин, Е.N. Гаврилова, A.N. Егоров, A.Ï. Осипов, Т.Г. Митрохина, Н.И. Киселева и .С.A; Еремин (71) Ордена Ленина, .ордена Октябрьской Революции и ордена Трудового

Красного Энамени ИГУ им.М,В.Ломоносова . (53) 577.15.07(088.8) (56) 1 ° J Clin. Invest., 1959,38,26.

2. Патент C2IA Р 3996345, кл. 424-12, опублик. 1976.

3. Патент CD В 4065354, кл. 195-63, опублик. 1977.

4. Патент CIRCA 9 4067774, кл. 195-63, опублик ° 1978.

5.Eur. J Biochem.1973,40,187-193

{54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕАГЕНТОВ

ДЛЯ И(ЯУНОХИИ4ЧЕСКОГО АНАЛИЭЛ путем взаимодействия гаптенового органического соединения с веществом-детектором иьв(унохимической реакции, отличающийся тем, что, с целью повьвиния чувствительности реагента, в качестве вещества-детектора используют и -(6-аминогексил)-ацетамидное производное никотинамидадениндинуклеотида или и -Р(-(6-аминогексил Ц ацетамидное производное аденоэинтрифосфата, предварительно модифицированное водораствори(йм карбодиимидом.

1067443

Изобретение относится к биохимии и касается способа получения реагентов для иммунохимического анализа широкого круга биологически активных веществ — белков, лекарственных препаратов, стероидных и пептидных 5 гормонов .в биологических жидкостях, в частности в сыворотке крови.

Известные реагенты для иммунохимическоЬо aH ализа получают ковалент ным связыванием соответствующего 10 антигена или гаптенового органического соединения с молекулой вещества, выполняющего роль детектора иммунохимической реакции.Гаптеновыми: соединениямй называют органические вещества, которые не дают самостоятельно иммунной реакции, но при связывании с иммуногеиным носителем вызывают специфическое образование антител к данному гаптену, причем в качестве метки (детектора) ис. пользуют радиоактивные изотопы f13, молекулы., способные флуоресцировать под действием определенных агентов(2), ферменты-лизоцим f3), оксидоредуктазы (4 ). Выбор способа получения ковалентного конъюгата антигена или гаптенового соединения с молекулой детектора определяется как природой антигена или гаптена, так и строением химического вещества, исполь- 30 эуемого в качестве детектора или метки иммунохимической реакции.

Наиболее близким к гредлагаемому является способ получения реаген-. та для иммунохимического анализа пу- 35 тем взаимодействия гаптенового органического соединения с вешествомдетектором иммунохимической реакции, в качестве которого используются ферменты — оксидоредуктазы, à 4р процес ведут при участии изобутилового эфира угольной кислоты.. В качестве гаптеновых соединений исполь- . зуют различные биологически активные, вещества — наркотики, барбитураты, 45 транквиллизаторы, стероидные и пептидные гормоны Е4).

Недостатком данного способа является то, что для большинства получаемых реагентов чувствительность не превышает 10 4 в 10 И. Максимальная чувствительность 5 .10 У. получена при определении морфина и его аналогов.

Цель изобретения — повышение чувствительности получаемого реагента. 55

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения реаген-та для иммунохимического аналИза, заключающимуся. во взаимодействии гап.тенового органического соединения с Я) веществом-детектором иммунохимической реакции, в качестве вещества-деigxrapa используют М" -(6-аминогексил )ацетамидное производное никотинамидадениндинуклеотида или г46 -(И†(б-аминогексилЦ ацетамидное производное аденозинтрифосфата, предварительно модифицированное водораств римым карбодиимидом.

Образование химической связи между молекулой кофактора и антигена и отсутствие в конечном продукте свободных молекул НАД и антигена доказано использованием ряда физикохимических методов-спектрофотометрически, газожидкостной хроматографией, электрофорезом в капилляре (изотакофорез) .

В качестве растворимого карбо:л да могут быть использованы любые продажные препараты карбодиимидов, содержащие третичные или четвертичные аминогруппы, например мета-пара-толуолсульфонат- М -циклогексил- и -(2-морфолинил-(4 )-этил )-, М -циклогексил- Й -(h -диэтиламиноциклогексил )или 1-этил 3(3-диметил-аминопропил) карбодиимиды. Условия проведения реакции и молярные соотношения реагентов являются одинаковыми для всех при веденных карбодиимидов. Выбор мета-пара-толуолсульфонат-N-циклогексил— — Ц -j2-морфолинил-(4 )-этил-|карбодиимида связан не.с его преимуществами как реагента, а с его высокой стабильностью, .Другие продажные карбодиимиды могут быть использованы только в свежеприготовленном виде.

Вначение рН определяется природой связываемого соединения и может варьироваться в довольно широких пределах рН 4-8 . Мольное соотношение реагентов 1:1, так как реакция протекает стехиометрически.

Химическую модификацию АТФ проводят следующим образом.

АТФ обрабатывают в течение 5-7 дней в темноте литиевой солью монойодуксусной кислоты, Образующееся при этом .N -карбоксилительное npot изводное нагреванием в слабощелочной среде (pH 8,5 переводят в аналогичное Й -производное. К полученному продукту добавляют последовательно раствор гексаметилендиаминдигидрохлорида и мета-пара-толуолсульфонат N-циклогексил. — И -(2-морфолинил-(4)-этил)-карбодиимида, поддерживая в реакционной смеси рН

4,5-5,0. АТФ-N6-(М вЂ” б-аминогексил1

-ацетамид выделяют хроматографически на колонке с катионообменной смолой .

Получение N — (6-аминогексил ) ацет"

6 амидного производного НАДа осуществляют по известной методике f5).

Предлагаемым способом могут быть получены конъюгаты АТФ и НАД с широким кругом гаптеновых биологически активных веществ, в том числе стероидными и пептидными гормонами, амиHQKHслотами, пептидами, целым рядом лекарственных пре1067443 паратов, например транквилизаторами, антибиотиками и т.д.

Способ обуславливает получение реагентов, чувствительность которых при определении соответствующих соединений составляет 10 @-10 И.

-12

П,р и м е р 1. Получение ЛТФ-Й"—

-(Й вЂ” (6-аминогек сил )) ацетамида, 5 r АТФ (8,3 ммоль) добавляют к

100 мл водного раствора монойодуксусной кислоты (15 r, 80 ммоль), предварительно нейтрализованной 2М раствором Ьi ОН до рН 6,5 и инкубируют в темноте при 30ОC в течение семи дней, поддерживая рН 6,5. Полученный N -карбоксиметил-АТФ осаждают. добавлением к реакционной смеси 800 мл охлажденного.до -20ОC этанола, выпавший осадок отделяют, промывают этанолом, эфиром и сушат под вакуумом. Выход М -карбоксиметил-ЛТФ составляет 90%. 100 мп водного раствора N -карбоксиметил-АТФ нагревают прн температуре 90ОС в течение 1,5 ч при рН 8,5. Полученный раствор N -карбоксиметил-ЛТФ охлаждают, доводят 1 М раствором

tlC9 рН до 2,75 и наносят на колонку с "Dowex" 1 2 (СГ) (2,5 60 см ), промывают 0,3 M раствором LiC1, рН 2,75. Для элюирования продукта используют. линейный градиент 0,3 M

ЫС1, рН 2,75 и 0,5 М LiC1, рН 2,0 (общий объем элюирующего раствора .

4л ) Элюат нейтрализуют 1 М раствором (, ОН и концентрируют на роторном испарителе до объема 60 мл. Выход N -карбоксиметил-АТФ составляет 52Ъ. K 60 мл N †карбоксиметил-АТФ добавляют 80 мл 1 И раствора гексаметилендиамин дигидрохлорида и 5 мл водного раствора мета-пара-толуолсульфонат М -циклогексил— Й - f 2-морфолинил- (4 )-этил) карбодиимида (3,24 r, 7,6 ммоль) . Реакцию проводят при комнатной темпе. ратуре в течение 1 ч при рН 4,7-5.

Продукт осаждают 1,5 л охлажденной смеси ацетон †этанол .(1:1! . Осадок отделяют, растворяют в 60 -мл воды, доводят с помощью НС0 рН до 5 и наносят на .колонку с "Dowex"

1 2 (С1 )(2,5 60 см). Колонку пред-. варительно промывают 100 мп 0,05 M раствора Li CP, рН 5, Конечный продукт элюируют линейным градиентом (0,05. M ЫСР с рН 6 и 0,35 М О СЙ с рН 2 при общем объеме 4 л . Элюат нейтрализуют, .концентрируют на роторном испарйтеле до объема около

50 мл и осаждают 500 мл охлажденной смеси этанол — ацетон (1:1). Выход .

АТФ-N -(М- 6-амнногексил)) ацетамида составляет 58%.

Пример 2. Получение конъюгата АТФ- N6-(N †(6-аминогексил )- ацетамид)инсулин.

Раствор, содержащий 30 мг АТФ,- - — N (й- (6-аминогексил)) ацетамида,, 6 мг инсулина и 42 мг мета-пара-то- ° луолсульфонат Й -циклогексил- N -f 2-.

-морфолинил- (4 ) этил ) карбодиимида в 5 мл 0,1 M трис.-ацетатного буфера, (рН 8,4 ), инкубируют 3 ч при 20ОС и оставляют на ночь при +4 С. Комплекс выделяют гель-хроматографией на колонке (1,0 30 см ) с сефадексом

0 -50; уравновешенным 0,1 M трис.-ацетатным буфером (рН 8,4). Полученные фракции контролируют спектрофотометрически, отбирая фракции, обладающие поглощением на 267 и 280 нм.

Пример 3. Получение конъюгата АТС-N -(Й вЂ (6-аминогексил) -ацетамид)тироксин.

9,8 мг ЛТФ-N -(N -(6-аминогексилЦ

-ацетамида и 9,5 мг тироксина раст.воряют в 5 мл 0,1 И ацетатного буфера, рН 4,4. К полученному раствору добавляют 6 мг мета-пара-толуол20 сульфонат М -циклогексил-й — (2-морt

° ôoëèíèë- (4 )-этил)карбодиимида. Реакцию ведут 24 ч при +4ОС, поддерживая с помощью 0,1 М раствора НС9, рН 4,8. Полученный комплекс выделяют

75 на колонке с сефадексом G =10, уравновешенной ацетатным буфером. Отбор фракций контролируют спектрофотометрически.

Пример 4.. Получение конъюгата ЛТФ-8 -(N †(6-аминогексил )-ацетамид)ампициллин.

12 мг АТФ-H -(N-(6-аминогексил ))

-ацетамида и 3 мг ампициллина растворяют в 6 мл трис.-ацетатного буфера (рН 7,8 ) и к полученному раствору добавляют 7 мг мета-пара-то- . ! луолсульфонат- И -циклогексил- Й— — (2-морфолинил- (4)-этил ) карбодиими.да. Реакцию ведут при комнатной температуре, поддерживая 0,1 M раство40 poM HCt значение рН до 6. Реакционную смесь оставляют на ночь при температуре +4 C и затем выделяют конъю. гат гель-фильтрацией-на колонке с сефадексом 5 =10, уравновешенной

45 0 05 М трис.-ацетатным буфером, рН 7,8.

Пример 5. Получение кон югата АТФ- Й(-(Й вЂ” (6-аминогексил )-ацет=. амид)-17- р -эстрадиол.

5О К 2,8 мл 10 И Ра<-твора АТФ- Я—

-(М вЂ” (6-аминогексил)) -ацетамида в

)дистиллированной воде добавляют

1 мл 2 10 M раствора мета-пара-сю

-толуолсульфонат М -циклогексил-Й (2-морфолинил- (4 )-этил)карбоди- нмида и 2 мл 10 М водного раствора

17-Р -эстрадиол (0 -карбоксиметил) оксима. 0,1 М раствором HCg доводят рН до 4,8. Реакцию проводят при комнатной температуте в тече60 ние 2 ч, а затем при температуре

4 С в течение суток. Полученный ковалентный конъюгат ЛТФ-17- ) -эстрадиол выделяют на колонке с сефадексом 3 =10, уравновешенным 0,1 М

65 трис .-ацетатным буфером, рН 7,8.

1067443. бавляют мета-пара-толуолсульфонат

5 N -циклогексил- и -f2-морфолинилвЂ(4)-этил1карбодиимид (176 мг ) и рН пературе в течение суток. Реак)0,öèoííóþ смесь освобождают от карбо15

65

Л р и м е р 6. Синтез И -(6-аминогексил )ацетамида НАД.

10 r НАД (15,1 ммоль) добавляют к 135 мл водного раствора моноподуксусной кислоты (30 г, 150 ммоль), предварительно нейтрализованного

2 И раствором km0H, рН раствора доводят до 6,5 и инкубируют в темноте две недели, постоянно поддерживая рН 6,5. Через 14 дней раствор подкисляют 6 М раствором HCf до рН

3,0, добавляют 250 мл этанола и раствор вливают в колбу, содержащую

1 5 л охлажденного до 0 C этанола, при интенсивном перемешивании. Выпадающий осадок фильтруют, промывают этанолоМ, эфиром и высушивают под вакуумом. Получают приблизительно 12 г светло-розового продукта.

12 г . М -карбоксиметил-НАД растворяют в 300 мл 2%-ного раствора

NaHCO, рН доводят до 8,5 и через раствор пропускают аргон. Затем для перевода кофактора в восстановленную форму добавляют 5 r дитионита натрия и оставляют стоять в темноте 2 ч при комнатной температуре, после чего пропускают в течеННе 10 мин кислород и 3 мин аргон.

Перегруппировку N -карбоксиметил-НАД.Н в N -карбоксиметил-НАД.Н

6 .осуществляют при нагревании до 75 С в течение 1 ч при рН 11,5. Окисленную форму модифицированйого кофактора получают ферментативным спо- . собом: добавляют к раствору кофактора 20 мл 2 M трис.-HCR 5 мл. ацетальдегида, 3 М НС до рН раствора 7,5 и 5 мг дрожжевой алкогольдегидрогеназы (2500 ед.) . За окислением следят спектрофотометрически при длине волны 340 нм. После прекращения реакции доводят рН до 3,,5 и добавляют один объем этанола. Затем раствор вливают в

10-кратный избыток этанола при энергичном перемешивании и суспензию оставляют в холодильнике на ночь. Осадок, содержащий .Й" -кар« боксиметил-НАД, фильтруют, промывают этанолом, эфиром и высушивают. Готовый продукт очищают ионообменной хроматографией на колонке с "Dowex" 1 4 (C0 ) (2,5 ° 70 см ), на которую наносят раствор модифицированного кофактора (рН 8,0), промы,вают дистиллированной водой (500 мл) .и 0,005 М раствором СаСР> (рН 2,7) до тех пор, по <а рН элюата не принимают значение 2,9 (2,5 л). Дпя элюирования конечного продукта ис.пользуют линейный градиент рН .и концентрации соли (.0,005 М СаС ; рН

2,0; общий обмем 8 л ). Элюат нейтрализуют Са(ОН) и концентрируют на роторном испарителе. Очищенный продукт осаждают этанолом. Выход продукта около 40%.

k -карбокси1летил-НАД (200 мг) растворяют в 4 мл раствора солянокислого гексаметилендиамина (1, 73 r), K раствору небольшими порциями до.— доводят до .4,8- 0,1 н. раствором НСС, Реакцию проводят при комнатухой темдиимида и гексаметилендиамина в колонке с сефадексом G =10 (1,2 50 см), уравновешенной дистиллированной водой. Фракции содержащие нуклеотид, объединяют, рН доводят до 7 и раствор пропускают через колонку с

"Dovex" 50 M ° 4 (Li ), (1 4 см). Чистый продукт получают осаждением этанолом. Выход продукта 50%.

П р и и е р 7. Получение конъюгата НАД-инсулин.

К 2 мл 10 4 M раствора H""--(б-аминогексил )ацетамид-НАД в дистиллированной воде добавляют 1 мг мета-пара«толуолсульфонат k -циклогексил-й -(2-морфолинил-(4)-этил)карбодиимида и 1 мл 2 ° 10 "М водного раство- ра инсулина, рН доводят до 4 8 0,1 н. раствором НС1. Реакцию проводят при комнатной температуре в .течение

2 ч, а затем при температуре 4 С о в течение суток. Полученный ковалентный конъюгат НАД-инсулин выделяют на колонке с сефадексом 4 =50, уравновешенной дистиллированной водой. Содержание конъюгата в различных фракциях контролируют спектрофотометрически, измеряя.оптическую плотность раствора при длинах волн 266 и 280 нм. Одна молекула

НАД связывается с одной молекулой инсулина.

Пример 8. Получение конъюгата НАД-тироксин.

10 мг N -(á.-аминогексил)ацетамид-

-НАД и 9,5 мг тироксина расворяютв 5 мп 0,1 М ацетатноГо буфера, рН 4,4 ° К полученному раствору добавляют 6 мг мета-пара-толуолсульфонат N -циклогексил-й -(2-морфоI линил-(4 )-этил)карбодиимида и рН доводят до 4,8 0,1 н. раствором НС, Реакцию проводят при комнатной температуре в течение 2 ч, а затем при температуре 4ОС в течение суток.

Полученный конъюгат НАД-тироксин мольного состава 1:1 выделяют на колонке с сефадексом Q =10 (1,2 ° 50 си), уравновешенной дистиллированной водой.

Пример 9 ° Получение комплекса НАД-ДОФА диоксифенилаланий..

10 мг N6- (6-аминогексйл")ацетамид:-НАД и 2,4 мг ), -диоксифенилаланина (ДОФА ) растворяют в 5 мл дистиллированной воды. К полученному раствору добавляют б мг мета-пара-толуол7 10674 сульфонат М -циклбгексил-t4 — (2-морфолинил-(4}-этил карбодиимида и рН доводят до 4,8 0,1 н. раствором HCt.

Реакцию проводят при комнатной температуре в течение 2 ч, а затем при 4 С в течение суток. Полученный о конъюгат НАД-ДОФА мольного состава

1г1 выделяют на колонке с сефадексом

G -10 (1,2 50 см), уравновешенной дистиллированной водой.

II р и м е р 10 Получение конъюгата НАД-17- р -эстрадиол.

К 2 мп 10 М раствора И -(б-аминогексил )ацетамид-НАД в дистиллированной воде добавляют 1 мл 2 10 - M раствор мета-пара-толуолсульфонат и -циклогексил- и -(2-морфолинил- (4 }-этил)кар-15 бодиимида и 2 мл 10 М водного раствора 17- р -эстрадиол-б-(о -карбоксиме- тил )оксима. рН доводят до 4, 8 О, 1 н. раствором HCP. Реакцию проводят при комнатной температуре в течение 2 ч, 2О а затем при температуре 4 С в тео чение суток. Полученный ковалентный конъюгат НАД-стероид(состава 1:1 выделяют на колонке с сефадексом G =10, pasHoBelaeHHoA дистиллированной 25 водой.

Пример 11. Получение конъюгата НАД-антиотенэин..

К. 2 MTl 10 4М раствора N6 — (6-аминогексил )ацетамид-НАД в дистиллированной воде добавляют 1 мг мета-пара-толуолсульфонат и -циклогексил-й. -(2-морфолинил-(4 }-этил 1карбодиимида и -1 мп 2-10 4М водного раствора антиотензина, рН доводят до 4,8 0,1 н. раствором HCt. Реак- цию проводят при комнатной температуре в течение 2 ч. а затем при температуре 4 С в течение суток.

Полученный конъюгат выделяют на колонке с сефадексом Я =10 ° 40

Пример 12. Определение инсулина с помощью реагента на основе

НАД.

1 мл сыворотки крови человека, разведенной в 10 раэ (0,1 мн сы- ., 45 воротки и 0,9 мл К-фосфатного буфера, рН 7,8 ), инкубируют с 200 мкл сыворотки морской свинки, содержащей антитела к инсулину, разведенной в 100 раз, и 1 мп 10 ®ОМ раствора НАД-инсулий, после чего вносят в кювету сйектрофотометра. В ту же кювету вносят 1,9 ип 0,05 Y. К-фос фатного буфера (рН 7;4), 0,1 мл смееи й-пара-нитрозо- и -диметилаланина (НДМА) и циклогексанола (НДМА растворяют в циклогексаноле до концентрации 40 мМ, а затем разбавляют 0,05 М К-фосфатным буфером до концентрации 300 мкМ/мл ) и 0,1 мЫ алкагольдегидрогеназы. 60

Измеряют убывание восстановленной формы НДМА по изменению оптической плотности при 440 нм. Ifo полученному значению скорости восстанов . ления НДМА, пользуясь калибровочной 65

43 кривой, определяют соответствующее значение концентрации инсулина °

Чувствительность определения инсулина 10Г М. Аналогично можно а определить содержание инсулина в других биологических жидкостях, например экстрактах поджелудочной железы, служащей сырьем для получения инсулина.

Пример 14. Определение инсулина с помощью реагента на основе АТФ.

1 мл сыворотки крови человека, разведенной в 10 раз (0,1 мл сыворотки и 0,9 мп трис.-ацетатного буфера, рН 7,8), инкубируют..со

100 мкл иммунной сыворотки морской свинки, разведенной в 1000 раз, .и 1 мл 10 îÌ раствора комплекса АТФ-инсулин при 37ОС в течение 30 мин.

Затем 0,5 мл реакционной смеси вносят в кювету биолюмииометра, содержащую 1 мл 0,1 М трис.-ацетатного буфера (рН 7,8), 0,2 мп 0,1 М раствора Мо904, 0,2 мл 0,4 мМ раствора люциферийа в том же буфере, н измеряют интенсивность биолюминесценции. Концентрацию инсулина в образце сыворотки определяют по величине биолюминесценции на аостроенном заранее калибровочном графике. концентрация инсулина — интенсивность биолюминесценции. Чувствительность определения 10 " М.

Полученные конъюгаты АТФ и НАД с гаптеновыми биологически активными веществами могут быть использованы для определения малых концентраций широкого круга биологически активных веществ в биологических жидкостях. Анализ основан на способности таких конъюгатов специфически взаимодействовать с антителами к биологически активному соединению, входящему в его состав.

Молекулы АТФ и НАД выполняют роль метки, позволяющей осуществить детекцию образующегося иммунного комплекса. Показано, что полученные реагенты практически полностью сохраняют свою коферментативную активность в реакции с люциферином, катализируемой люцифераэой светляков, и с помощью ферментативиых систем регенерации кофакторов. Это позволяет применить их для детекции иммунной реакции °

Использование предлагаемых коныегатов с АТФ дает возможность повысить чувствительность определения на два порядка по сравнению с иэвест ными модификациями иммунохимического анализа.

Предлагаемый способ может найти применение в медицинской диагностике, где черезвычайно остро стоит проб лема быстрого определения малых концентраций целого ряда фиэиблогиЧес» ки активных соединений.