Способ определения активности ферментов крови после длительного хранения

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ КРОВИ ПОСЛЕ ДЛИТЕЛЬНОГО ХРА .НЕНИЯ путем биохимического анализа пробы, отличающийся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, пробу крови наносят на беззольный фильтр или хроматогра1 J - - а. -J. /Л фическую бумагу, высушивают при комнатной температуре и хранят в течение 1-30 сут без доступа влаги, затем кровь элюируют физиологическим раствором в течение 25-30 мин, определяют активность фермента и значение исходной активности фермента вычисляют по Формуле frn-tOO Л. Гь Afl - активность фермента после где хранения образца высушенной крови; а и Ь - постоянные величины для g каждого фермента, опре (Л деленные эмперическим путем; п - количество суток хране-, ния.

П9) П1) СОЮЗ СОНЕТСНИХ

СОЦИАЛИСП4ЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК цд) 501 М 33 48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

А „400

0 а.Ъ"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3358494/28-13 (22) 07.09.81 (46) 23.03.84. Бюл. У 11 (72) B..A.Иванова и М.А.Ахматова (53) а 616.-07(088.8) (56) 1. Мартинек К., Торчилин В.

Основные принципы стабилизации ферментов. — В кн. Инженерная знзимология и биоорганический катализ. Итоги науки и техники. Сер. "Биологическая химия", т.12, 1978, с."7-48.

2. Подольский М.В. Высушивание препаратов крови и их заменителей.

N., "Медицина", 1973, с.130-134. (прототип). (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ КРОВИ ПОСЛЕ ДЛИТЕЛЬНОГО ХРА.НЕНИЯ путем биохимического анализа пробы, отличающийся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, пробу крови наносят на беззольный фильтр или хроматографическую бумагу, высушивают при комнатной температуре и хранят в течение 1-30 сут без доступа влаги, затем кровь элюируют физиологическим раствором в течение 25-30 мин, определяют активность фермента и зна-. чение исходной активности фермента вычисляют по формуле где А„ . — активность фермента после хранения образца высушен- . ной крови, 0 и Ъ вЂ” постоянные величины для g каждого фермента, определенные эмперическим путем, n — количество суток хране- С, ния.

1081541

Ап 400

Ao=— о Ь"

45 где An — активность Фермента после хранения образца высушенной крови, а иЬ вЂ” постоянные величины для каждого фермента, определяемые эмперическим путем, количество суток хранения.

Способ осуществляется следующим образом.

0.01-0.04 мл крови наносят на впи-55 тывающую подложку (например безвольный фильтр, хроматографическую бумагу и т.п.) в виде нескольких полосок, число которых определяется количеством планируемых, анализов. 60

Высохшие образцы крови хранят без доступа влаги над силикагелем или хлористым кальцием в целофановом пакете и т..п. Предельный срок хранения устанавливается экспериИзобретение относится к биохимий, а именно к способам количественных исследований активности ферментов, и может быть использовано при лабораторных и клинических анализах крови.

Известен. способ определения активности ферментов после длительного хранения путем мобилизации их на различных подложках (1) .

Однако этот способ длителен, тре- 10 бует очистки ферментов, не пригоден для диагностического анализа ферментов крови.

Известен также способ определения активности ферментов крови путем 15 высушивания препаратов крови с последующим растворением их в физиологических растворах для дальнейшего биохимического анализа p) .

Однако этот способ длителен, тре- 0 бует специального оборудования (леофильная сушка) и не пригоден при заборе и фиксации проб для анализа в полевых условиях.

Целью изобретения является ускорение и упрощение количественного определения активности ферментов крови, длительно сохраняемой для диагностических анализов.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения активности ферментов крови после дли ельного хранения путем биохимического анализа, пробу крови наносят на беззольный фильтр или хроматографическую бумагу, высушивают при ком-.35 .натной температуре и хранят в тече-. ние 1-30 сут. без доступа влаги, затем кровь злюируют физиологическим раствором в течение 25-30 мин, проводят биохимический анализ и значение ис- 40 ходной активности фермента определяют по формуле

t ментально для каждого фермента и обусловлен тем, чтобы спонтанное уменьшение активности не превышало 50% от уровня в свежей крови. Хранение образцов крови в высушенном виде до 30-60 сут вполне удовлетворяет этому необходимому условию.

Затем пятна крови вырезают, элюируют с .помощью физиологического раствора на холоде. Для точности анализа условия элюации должны быть стандартными: температура 0-4 С, опО ределенное время (наиболее оптимально 25-30 мин), одинаковое по интенсивности и частоте размешивание проб. В полученном элюате неэамедли" тельно производят определение активности Фермента тем методом. которым пользуются при анализах свежей крови, Искомую величину активности исследуемых ферментов находят с учетом степени инактиваиииг зависящей от прол лжительности хранения образцов высушенной крови, A — 100

A„ о к где Ап — активность фермента на и

0 сутки хранения образца высушенной крови, измеренная в результате биохимического анализа", поправочный коэффициент,. учитывающий степень ин.— активации фермента наЬ сутки.

Активность ферментов в образцах высушенной крови по мере увеличения длительности их хранения снижается по сравнению с величинагли в свежей крови °

Это снижение активности Ферментов происходит закономерно и математически может быть выражено экспоненциальной кривой типа

В данном уравнении за ) принимаем .величину сохранения активности фермента в процентах от исходного уровня, зависимую от длительности хранения образцов высушенной крови

Тогда

An.40О

0 Ь"

Численные значения а и Ъ являются постоянными величинами для каждого фермента и определяются,экспериментально.

Так, для каталазы процент сохранения активности на и сутки хранения крови 75,8+0,987",для глюкозо-б-фосфатдегидрогенаэы 97,7 0,980 ;для холинэстеразы 98.0 п0,990"для тиоловых групп 77,6 0,986".

1081541

Величина процентного сохранения активности Ферментов найденная в результате экспериментальных исследований путем сравнения результатов определения активности Ферментов в образцах свежей и высушенной крови и апробированная на точность анализа, может быть использована пюи исследовании ферментных показателей любых образцов крови, сохраняемой длительное время в высушенном виде.

П ю и м е р 1. Определение активности глюкозо-б-Фосфатдегидюогеназы в крови.

A. Активность фермента в свежей. крови белых крыс 4 87 < 0,18 М

ИААФ +(мл)мин. Актйвность Фермента в высушенных образцах крови (А0) на 3 сут хранения 4,32 на 9 сут

3 88: на 19 cvT 3 00. 20

Пля проверки точности способа истинную активность Феюмента опюепеляли в разные-сроки хранения образцов высушенной крови и получили следующие результаты:

Д5 (00

Z5,5.0,987 5 A4о 00

) (00

444 =

75,Е, О 987го

25 . Б. AK THíность фермента в крови людей до испытаний в свежей крови 5,30 — 0,04.

После пребывания испытуемых в экстремальных условиях активность фер3р мента составила

Предлагаемый способ позволяет расширить диапазон использования ферментных показателей при диагностических анализах крови и при лабора4О торных биохимических исследованиях: в лабораторных условиях дает возможность производить массовый забор крови для последующего их анализа в любой отдаленный срок в пределах до

45 б0 сут, вне лабораторной базы взятые на анализ микроколичества крови могут быть удобно, надежно и просто сохранены и при необходимости транспортированы для последующего иссле5р дования в лабораторных условиях, т.е. возможно проводить биохимические исследования на современном научнометодическом уровне.

Применение предлагаемого способа позволит использовать ферментные показатели, как наиболее чувствительные критерии изменения гомостаза, для оценки неблагоприятного действия на организм вредных факторов окружаю6О щей среды непосредственно на местах производственной или служебной деятельности людей;

Тираж 823 Подписное.Ужгород, ул.Проектная, 4

Aq <0O 4,< 00

0 07,7 О 9809 > о 97: i.o,980 "- 4,70 я = 4,то

А <00 %88 10о о 97,7 0.980з > o т,7.0.9809

4 .<оо т,о

4, тт.о.тоо, 4о отт отоо т 4,4О, Значения активности Фермента,,полученные пюи исслеловании образцов высушенной крови с разными сроками хранения, близки к определенным в свежей крови и находятся в пределах погрешности анализа. что вполне допустимо при биохимических исследованиях.

Б. Определение активности глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы в крови людей. По резчльтатам обследования по (А,Iи после (А0)пребывания испытуемых в экстремальных условиях получено

А 5 00, n4 100

4о —, II - —. . тов,то °

97,7 0,980 5 0 97,7 0,98045 (т д 40 ° (00 ii 2Я,40 (00

4а 4о i 4о -тт.94.

07,7 0,980 97 98p40 =

Разница в полученных значениях активности фермента в крови одних и тех же людей свидетельствует об изменении его активности в результате воздействия неблагоприятных Факторов внешней среды.

ВНИИПИ Заказ 1540/39

Филиал ППП "Патент", г

Пример 2. Определение ак,тивности каталазы крови.

А. Активность фермента в свежей крови лабораторных животных (белых крыс) 5, б 4 О, 25.

Активность фермента в высушенных образцах крови этих же животных ца 5 сут хранения 3,82, на

10 сут 3,75, на 20 сут 3,50. Истинная активность фермента с учетом инактивации за эти, сроки хранения йолучилась.

3,82. (GO

Ао = о53810,!8

75,8 0,0875

3,75 (00

А =5, 5+ 0,48

7g,8 0,q8z

9.50 100

До =, =5,66+0, 8.

75,Ü ° 0 9ф72о

301 100

А0- =870 0 18

75,8 0,9879