Способ окраски нервных клеток

 

СПОСОБ ОКРАСКИ НЕРВНЫХ КЛЕТбК , включакищй инъекцию в нейроны водного раствора соединения кобальта , последующую инкубацию и фиксацию , приготовление препарата и контрастирование красителем, отличающийся тем, что, с целью повышения качества окраски, инкубацию и фиксацию проводят одновременно в растворе, содержащем насьпденный раствор оС-нитрозо- -нафтола и альдегидный фиксатор при рН 7,4-7,5, далее препараты дополнительно фиксируют в альдегидном фиксаторе, а контрастирование проводят гемалауном.

COOS СОВЕТСКИХ

CCIOWNÎ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕ

И АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ . » ЯЕЮФФУ - -ЗКс Ю1нб 4Р-Г. Яй « 2

Ф \

° Ю

° °

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

fIO ДЕЛАМ И90БРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ, (21) 3377113/28-13 (22) 06. 01. 82 (46) 30.03.84. Бюл. В 12 (72) О.В.Зайцева и Т.Н.Крячкова (71) ЛГУ им. А.А.Жданова и Государственный союзный научно-исследовательский химико-аналитический институт (53) 616-091.8 (088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

В 321714, кл. С 01 Н 1/30, 1971

2. Mobbs Р.G. Golgi staining of

material Cohtaining cobalt-filled

profiles in the insect CNB. В rain

Research, 1976, ч. 105, 563-566.

„80.„1083095 A

3(59 С 01 Н 1 28 А 61 В 10 00 (54) (57) СПОСОБ ОКРАСКИ НЕРВНЫХ КЛЕ TOk включающий инъекцию в нейроны

1 водного раствора соединения кобальта, последующую инкубацию и фиксацию, приготовление препарата и контрастирование красителем, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью повышения качества окраски, инкуба- . цию и фиксацию проводят одновременно в растворе, содержащем насыщенный раствор а(,-нитрозо-/3-нафтола и альдегидный фиксатор при рН 7,4-7,5, далее препараты дополнительно фиксируют в альдегидном фиксаторе, а контрастирование проводят гемалауном.

1 10

Изобретение относится к медицине, в частности к области исследования нервной системы.

Известен способ окраски нервных клеток путем суправитальной окраски метиленовым синим с последующей докраской азотнокислым серебром $1j, Недостатком способа является невысокое качество окраски тела нервной клетки.

Наиболее близким по технической сущности является способ окраски нервных клеток, включающий инъекцию в нейроны водного раствора соединений кобальта, последующую инкубацию и фиксацию, приготовление препарата и контрастирование красителя(2).

Недостатком способа является неустойчивость окраски нервных клеток вследствие появления при инкубации серо-бурого фона от сульфида аммония

Цель изобретения — повышение качества окраски нервных клеток.

Указанная цель достигается согласно способу окраски нервных клеток, включающему инъекцию в нейроны водно-. го раствора соединения кобальта, последующую инкубацию и фиксацию, приготовление препарата и контрастирование красителем, при котором инкубацию и фиксацию проводят одновременно в растворе, содержащем насыщенный раствор о -нитрозо-/5-нафтола и альдегидный фиксатор при рН 7,4-7,5, далее препараты дополнительно фиксируют в альдегидном фиксаторе, а контрастирование проводят гемалауном.

Способ осуществляют следующим образом".

В эксперименте изолируют центральную нервную систему, например, моллюска Lymnaca stag nalis. Выбирают нервные клетки, в которые инъекцируют водньй раствор хлористого кобальта путем его пассивной диффузии через перерезанные перифе рические отростки нервной клетки.

Далее нервные клетки щУомывают в двух сменах физиологического раствора.

Фиксацию и инкубацию осуществляют в растворе, содержащем насыщенный

l раствор o(,— íèòðîçî-pj-нафтола и альдегидный фиксатор при рН 7,4-7,5, затем препараты дополнительно фиксируют в глютаровом альдегиде и пара.форме, промывают в фосфатном буфере и докрашивают гемалауном, приготав83095 2 ливают срезы, которые заключают в даммарову смолу.

Пример 1. В нервные клетки изолированной центральной нервной системы моллюска (Lymn аса staglis) размером 1 5-3 мм, вводят водный раствор хлористого кобальта. Введение проводят при 14 С в течение о

1 сут.

1п Промывку осуществляют в двух сме нах физиологического раствора, в каждой по 2 мин.

Промытые препараты помещают в инкубационный раствор, состоящий из

aL-нитрозо-р-нафтола на буферной смеси, .содержащей 0,4Х параформ и

1,0Х раствор глютарового альдегида

D, при рН 7,4. Температура фиксации ЗОС

Инкубационный раствор готовят следующим образом.

Раствор А. В 40 мл подогретой дистиллированной воды растворяется

400 мг параформа.

Раствор Б. К раствору А добавляетZg ся 200 мг d.-нитрозо- 3г-нафтола. Раст- вор подогревается при постоянном помешивании до полного растворения с -.нитрозо-р-нафтола.

Раствор В. Раствор Б доливается до 95 мл фосфатным буфером с рН 7,5.

Раствор Г. К раствору В добавляет. ся 5 мл 25Х глютаральдегида, и фильт. руется через вату.

Время инкубации зависит от разме35 ра.препарата, критерием оценки.служит появление ярко-алой окраски нейронов. Для нейронов размером 1,5-3,0 время инкубации составляет 10-15 мин °

Далее препараты переносят в фиксатор, состоящий из 0,5Х раствора параформа

® и 1,0Х раствора глютарового альдегида при рН 7,4, на 4 ч. Промывку пре-, ! парата проводят в фосфатном буфере того же рН в течение 1 ч.

Промытые препараты помещают на

12-24 ч в 20Х-ный раствор сахарозы на фосфатном буфере с рН 7,4, приготавливают замороженные срезы, которыс докрашивают гемалауном, обезвоживают в возрастающих концентрациях изобутилового спирта и заключают в даммаровую смолу.

Пример 2. Готовят препараты нервных клеток изолированной центральной нервной системы, размером

4,0-7,0 мм (моллюска Н elis vulgaris L). Введение хлористого кобальта осуществляют при 14 С в течение о

2 сут.

Составитель Л.Стебаева

Техред Т.Фанта

Редактор С.Юско

Корректор М.Шароши

Заказ 1734/38 Тираж 823 Подписное

ВИИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул..Проектная, 4

3 1

Промывку осуществляют в трех сменах физиологического раствора, в каждой по 3 мин.

Промытые препараты помещают в инкубационный раствор, как в примере 1, Время инкубацни составляет 1520 мин. Дофиксацию проводят в буферных растворах альдегидов в течение

10 ч.

Последующую промывку осуществляют в течение 3 ч.

Отмытые от фиксирующей смеси препараты быстро обезвоживают в возрас-. тающих концентрациях изобутилового спирта. Затем переносят в две смены смеси (1: 1) 99,5й-ного изобутилового спирта и хлороформа, а 5 мин в каждой помещают на 10 мин в хлороформ и затем на 3 ч смесь хлоро083095 4 форма с парафином при 37оС (1:1).

Потом из препаратов приготавливают срезы, которые подкрашивают гемалауном по стандартной прописи.

5 Для получения целлоифиновых срезов отмытые от фиксирующей жидкости препараты проводят по стандартному. методу.

Применение предлагаемого способа

1р повышает качество окраски нервных клеток вследствие улучшения дифференцировки клеток от окружающих тканс., 1, а также повышения стойкости.окрашивания.

Способ нашел применение при ис следовании принципов формирования рефлекторных актов нервной системы и вопросов адаптивного поведения.