Способ определения кислотности фагоцитов

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛОТНОСТИ ФАГОЦИТОВ путем смешивания их с фагоцитируемыми частицами с поспедукидей инкубацией смеси, определением рН среды с помощью индикатора/ отлич ающийся тем, что, с целью повышения точности способа, в качестве индикатора используют 125-175 мкМ сернокислой меди и 20-30 мкМ ферроцианида калия, затем в ряд инкубационных смесей добавляют цитрат натрия от 2 мкМ до образования ферроцианида меди в исследуемой пробе, а кислотность фагоцитов (У) определяют по формуле У 5,212.Х-°° , где X - концентрация цитрата натрия в пробе с образовавшимся ферроциан;вдом меди, мкМ.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„.ЯО.„1091068

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3395784/28-13 (22) 1.2.02.82 (46) 07.05.84..Бюл. Ф 17 (72) А.В.Храмцов и В.M.Çåìcêoâ (71) Научно-исследовательский институт иммунологии (53) 611-018.53(088.8) (56) 1.Geisow М.I. Hart P.D.

Young М.К.. Temporal Changes of Lysosome and Phagosome pH During Phagolysosome Formation in MacrophagoStudies by Р1иотевсепсе Spectroscopy

"J.Сеl1.Biology", 1981, v".89, р. 645652.

2. Jacques Y.V., Bainton D.I.

Changes in pH Mithen the Phagocytic

Vacuoles of Human Neutrophils and

Monocyter.- Laboratory Investigation"

1978, ч. 39, р. 179-185 (прототип).

3уц G 01 N 33/48; А 61 В 10 00 (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛОТНОСТИ ФАГОЦИТОВ путем смешивания их с фагоцитируемыми частицами с последующей инкубадией смеси, определением рН среды с помощью индикатора, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, в качестве индикатора используют 125-175 мкМ сернокислой меди и 20-30 мкМ ферроцианида калия, затем в ряд инкубационных смесей добавляют цитрат натрия от 2 мкМ до образования ферроцианида меди в исследуемой пробе, а кислотность фагоцитов (У) определяют по формуле

y = 5,212 Х о,о где Х - концентрация цитрата натрия в пробе с образовавшимся ферроцианидом меди, мкМ.

Кислотность определяют по образоанию осадка в реакции между Cu + -4

t.Fe(CN) 3, которые в нейтральном астворе образуют осадок ферроцианиа меди

2Си 2 + )Fe (CN) 3 Ñu2 PFe (CN) < ) 4.

Добавляя предварительно в раствор азличные количества хелатообразующе. о агента — цитрата, можно вызывать ормирование осадка ферроцианида и при строго определенных значеях рН в пределах от 3,00 до 5,00 на основании этого построить кабровочную кривую.

Состав опытных смесей для построея калибровочной кривой: среда 199, зличные количества цитрата натрия, ответствующие количества хлорида трия, 125-175 мкМ сернокислой меди;

-30 мкИ ферроцианида калия.

Количество цитрата натрия, вводие в опытные смеси, варьирует от 2

35009 мкИ, определяется.по формуУ = 5,212 К,где Х вЂ” концентра0,055 я цитрата натрия, мкИ, У вЂ” значее рН, и зависит от определяемой личины рН. Нижние значения цитрата трия обусловлены максимально возжной точностью дозаторов, превышее верхнего предела значений цитранатрия приводит к нарушению услой изотоничности опытных смесей. Коннтрационные значения всех .других агентов находятся в зависимости от нцентрации цитрата натрия, изменеих в любую сторону от указанных елов ведет к нарушению закономер ти протекания реакции.

Кислотность фагоцитов определяют сением их с фагоцитируемым матеом в опытные- смеси и электроннороскопически регистрируют в клетобразование осадка ферроцианида и.

Пример 1. Построение кривой мирования ферроцианида меди при

3,00-5,00 в зависимости от конценти цитрата натрия (см. табл.).

Исходный рН растворов 7,2, рН творов изменяют добавлением н. НС1 под контролем рН-метра — 340) . Светопоглощение оценивана спектрофотометре СФ-26 при нм.

В результате проведенных исследоий получена кривая образования ка ферроцианида меди при опреенных значениях рН в зависимости концентрации цитрата натрия. Урав1 1091068

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в медицин- в ской цитохимии для исследования пато. и логии клеток.

Известен способ определения кис5 д лотности фагоцитов путем флуоресцент* ной спектроскопии, основанный на том, что спектр возбуждения флуорес- р цина изоглиоцианата является чувст- г вительным к рН среды Е1 3. 10 Ф

Однако чувствительным участком мед данного способа является рН от 5 ни до 7, тогда как за этими пределами и способ нечувствителен. ли

Известен также cnocot> определения кислотности фагоцитов путем смешива- ни ния их с фагоцитируемыми частицами, ра последующей инкубации смеси и добав- со ления реагента для определения рН, на среды Г21. 20 20

Однако при известном способе используются индикаторные красители, мо такие, как нейнтральный красный, до бромкрезоловый фиолетовый, бромкре- ле ,золовый зеленьй, бромфеноловый синий > ци 25 которые имеют интервал перехода окраски 2 ед. рН. В этих пределах происходит плавный переход окраски черезвсе цветовые оттенки, визуально труд- но отличимые друг от друга. Все это делает точность измерения рН с исполь30 зованием перечисленных индикаторов равной половине интервала перехода це окраски красителя, а именно 1 ел. рН. ре

Цель изобретения — повышение точ- ко ности способа при определении функ- З5 ние циональной активности клетки. пред

Указанная цель достигается тем. нос что согласно способу определения киелотности фагоцитов путем смешива- вне ния их с фагоцитируемыми частицами 40 риал с Последующей инкубацией смеси и on- мик ределением рН среды с помощью индика- ках тора, в качестве индикатора исполь-. мед зуют 125-175 мкМ сернокислой меди и 20-30 мкМ ферроцианида калия, за- 45 фор тем в ряд инкубационных смесей добав- рН ляют цитрат натрия от 2 мкИ до обра- раци зования ферроцианида меди в исследуемой пробе, а кислотность фагоцитов рас (У) определяют.по формуле 50 04

„= 5 212 "55 (рН где Х вЂ” концентрация цитрата натрия ют в пробе с образовавшимся 565 ферроцианидом меди, мкМ.

Образование ферроцианида меди on- 55 ван ределяют электронномикроскопически. осад

Способ осуществляют следующим дел . образом. от

3 10910 нение регрессии, рассчитанное методом наименьших квадратов, имеет -о,оа следующий вид:У = 5,212 Х „,где

Х вЂ” концентрация цитрата натрия, мкМ, У вЂ” значения рН. Коэффициент корреляции равен r = 0,996 (р (0,001) .

Полученная кривая использована при изучении рН в фагоцитируемых вакуолях клеток в системе in vitro„

Фагоциты получают промыванием брюшной полости мышей СВА раствором Хенкса: на 250 мл — 500 мг бычьего сывороточного альбумина и 5000 ед. гепарина. Клетки осаждают центрифугированием в течение 8 мин при

1200 об/мин на холоде. После этого осадок ресуспендируют в растворе

Хенкса с 0,2Е-ным бычьим сывороточным альбумином и вновь центрифугируют при тех же режимах. Клетки ресуспендируют в среде 199 и инкубируют в опытных смесях (1-7). Время инкуба. ции составляет 60 мин на водяной бане нри 37оС и постоянном встряхивании (амплитуда — 4, частота — 1

Universal shakertyre 327). В качестве фагоцитируемого материала используют частицы латекса. Количество клеток в инкубационной среде 1 х х 10 к/мл.

Ь

После инкубации клетки осаждают центрифугированием (3000 об/мин в течение 5 мин) и готовят стандартно для электронномикроскопических исследований. -Для этого полученные

; 35 осадки фиксируют в 4Х-ном растворе параформальдегица на растворе Хенкса в течение 3 ч, постфиксируют .

1Х ным раствором четырехокиси осмия в течение 3 ч, обезвоживают в возрас тающем ряду ацетона (от 70 до 1003), 40 заливают в смесь эпок-аралдит, поли- . меризуют в течение 48 ч. Ультратонкие срезы получают на ультрамикротомах фирм "LKB" (Швеция) и "Sorvall" (США).

Материал просматривают в электронных

45 микроскопах при ускоряющем напряжении 60-80 кВ.

Пример 2. Все продукты полностью соответствуют процедурам, описанным в примере 1, за тем лишь ис50 ключением, что в качестве фагоцитируемого материала вместо частиц латекса используют опсонизированный зимозан.

В фагосомах макрофагов, содержащих 55 частицы латекса или зимозана, которые инкубировались в опытных смесях, формирующих ферроцианид меди при рН

68 4

4, 50-3, 75, наблюдают электронноплотные осадки. Тогда как в микрофагах, инкубированных в смесях, дающих осадок при рН 3,50-3,00 электронноплотных осадков не найдено. Таким образом, используя предлагаемый способ, установили, что нижний предел закисления рН в фагоцитируемых вакуолях макрофагов колеблется между 3,50 и 3,75.

Найдено также образование электронноплотных осадков не только в полностью сформировавшихся фагосомах с поглощенными частицами, но и в местах контакта фагоцитируемого материала (зимозан) с плазматической мембраной макрофагов. Глубина закисле-. ния в местах контакта также находится в пределах рН 3,50-3,75.

Предлагаемый способ позволяет регистрировать электронноплотные осадки без дополнительного контрастирования ультратонких срезов. Однако, при необходимости контрастирования можно использовать только уранилацетат, но не цитрат свинца; так как его раствор вызывает растворение осадка ферроцианида меди.

Для доказательства того, что электронноплотные осадки формируются именно в результате изменения рН, а не из-за усиленной генерации супероксидных радикалов, была поставлена контрольная реакция. В отсутствии клеток была проверена опытная смесь в системе квантиноксидазы, продуцирующей суперксидные радикалы и имитирующей тем самым аналогичное функционирование фагоцитирующих клеток. Даже заведомо больший уровень суперксидных радикалов, чем в извест. ных биологических системах, не вызывает образования осадка ферроцианида меди в исследуемой опытной смеси.

Проведена контрольная реакция при 2-4 С и в присутствии 0,2Х-ного, раствора азипа натрия для доказательI ства того, что наблюдаемые электронноплотные осадки представляют собой результат функционирования фагоцитирующих клеток и их ферментных систем.

Эти условия не препятствуют только прилипанию фагоцитируемого объекта к клетке, большинство же протекающих биохимических процессов ингибируются. При таких условиях никаких электронноплотных осадков в клетках не наблюдают.

Смесь

Состав

Пример

4 5

3 б J. 7

Среда 199

0,1 М цитрат натрия, ил (Ка С Н О >—

25,8 г/1000 ип) На каждую опытную смесь по

10 мп

0 025 0,05 0,1 0,2 1 9 5 17

0,427 М хлорид натрия, мл

34 25,5 18

34,975 34,85 34,9 34,8 (NaCl—

25,:8 г/1000 rex).

30 мМ сернокислая медь .(CuS0 5Н20

7,5 г/1000 мл) На каждую опытную смесь по

0,5 мл

5 мМ ферроцианид калия (K+Fe (СИ) ЗН 0 — 2,11 г/1ООО ) На к а ж д у ю о и ы т н у ю с м е с ь по

0,5 мл

Дистиллированная вода

На к а ж д у ю о п ы т н у ю с м е с ь по

54 ил

Составитель Е.Житникова

Техред Т.Фанта Корректор В.Бутяга

Редактор Л.Филь

Заказ 3073/40 Тираж 823 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам,изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.-4/5

Филиал ППП "Патент", r.Óæãîðîä, ул.Проектная, 4

Ф 1091068 б

Из результатов двух проведенных . гоцитируемым объектом соединения, контрольных реакций видно, что элект1 вступающие в реакцию при кислых знаронноплотный осадок ферроцианнда ме- чениях рН, появляется возможность ди формируется именно при кислых испольэовать в качестве фагоцитирузначениях рН, которые являются ре- s емого материала значительно большее зулътатом функциональной активности количество. инициаторов фагоцитоза. клеток. При известных способах таким матеПриведенные примеры свндетельст- риалом служат только дрожжевые клетки. вуют о том, что предлагаемым спосо- Изучаемые предлагаемым способом бои можно определить рН субклеточных 10 свойства определяют бактерицидное структур, получаемые данные имеют действие фагоцитирующих клеток на высокую точность (определение рН ко- потогенные микроорганизмы, осуществлеблется в пределах 0,25, в то вре-,ление антиопухолевого контроля в мя как при способе световой микро- организмах и т.д. Способ применим скопни этот предел составляет 1,0). 15 как для изучения механизмов, происВ связи с тем, что исчезает необ- ходящих в клетках, так н воэможньи ходимость химически связывать с фа- патологических отклонений от нормы.