Способ титрования энтомопатогенных вирусов
СПОСОБ ТИТРОВАНИЯ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ ВИРУСОВ, включающий заражение культуры клеток вирусом и анализ зараженных клеток, отличающийся тем, что, с целью повы .шения точности, анализ зараженных .клеток проводят по признаку подавления деления зараженных клеток.
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
O9l (}}}
y }} С 12 }} 7/00
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
Пб ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3489468/30-15 (22) 03.09 ° 82 (46) 23.07.84, Бюл. }}- 27 (72) С.В. Комиссаренко и И.Н. Скуратовская (71) Институт молекулярной биологии .и генетики АН Украинской ССР (53) 632.937. 16(088.8) .(56) 1..Использование вирусов для борьбы с вредными насекомыми и переносчиками болезней. Женева, Изд-во
В03, 1975, с. 40-92.
2. Komissarenko S. V, et а1. Arch.
of Virology, 1972, 61, }} 4, р.347-349. (54) (57) СПОСОБ ТИТРОВАНИЯ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ ВИРУСОВ, включающий заражение культуры клеток вирусом и анализ зараженных клеток, о т л и ч а— ю шийся тем, что, с целью повышения точности, анализ зараженных клеток проводят по признаку подавления деления зараженных клеток.
1104155
1
Изобретение относится к способам количественного определения инфекционности вирусов, применяемых для биI ологической борьбы с насекомыми-вредителями лесов и сельскохозяйственных культур, Согласно рекомендации ВОЗ, в качестве биоинсектицидов для насекомых - вредителей выбрана группа ба" куловирусов (1) .
f0
Важнейшей характеристикой биоинсектицидов как вирусных препаратов является их инфекционность, поэтому актуальная разработка методов определения инфекционности таких препаратов. Инфекционность вирусных препаратов определяют на насекомых и на перевиваемых культурах клеток насекомых, которые в последние годы получают все большее развитие, открывая возможности излучения вирусов в стандартных условиях. Приемы, используемые в работе с культурами клеток насекомых, основаны на методах, ранее разработанных для культур клеток позвоночных, Известен способ титрования энтопатогенных вирусов, включающий заражение культуры клеток вирусом и анализ зараженных клеток, например, по бляшкам (2) .
Однако положительный результат титрования методом бляшек зависит от. многих факторов, например от качества- питательных сред, посуды, физиоло35 гического состояния культуры, которое не всегда позволяет получить хороший монослой. Основное условие при постановке метода бляшек — заданные сроки и. необходимое количество. Кроме
40 того, постановка метода бляшек обусловливается использованием дорогостоящей импортной агароэы, что затрудняет применение метода в широком масштабе.
Титрование по бляшкам не применимо также и для тех вирусов ядерного полиэдроза, которые не образуют бляшки в чувствительной культуре, а также в тех случаях, когда чувствительная культура находится в суспен- 50 зионном или полусуспензионном состоянии.
При изучении культуры клеток насекомых, зараженной вирусом ядерного полиэдроза, установлено подавление синтеза клеточной ДНК в сравнении с незараженными культурами, что сопро вождается подавлением роста клеток.
Целью изобретения является повышение точности способа титрования энтомопатогенных вирусов.
Цель достигается тем, что анализ зараженных клеток проводят по признаку подавления деления зараженных клеток.
Пример. Для титрования готовили десятикратные разведения исходного вирусного материала, представляющего собой культуральную жидкость, содержащую внеклеточный свободный вирус ядерного полиэдроза тутового шелкопряда, полученный из культуры клеток непарного шелкопряда SCI.д-135, зараженных вирусом ядерного полиэдроза тутового шелкопряда. Разведения готовили на свежей питательной среде.
Затем по 0,2 мл каждого разведения вносили в пробирки. На разведение брали по четыре пробирки. По 0,2 мл питательной среды вносили и в четыре контрольные пробирки. Готовили клеточную суспензию и по 0,8 мл вносили в пробирки с разведенным вирусным материалом. Суспензию готовили с таким расчетом, чтобы в каждую пробирку попадало одинаковое количество клеток (1-3 10 клеток/мл). Не сливая вирус, пробирки инкубировали в термостате при 28 С в течение 10-12 дн. в опыо тах с вирусом ядерного полиэдроза тутового шелкопряда, вирусом ядерного полиэдроза большой вощинной моли и вирусом ядерного полиэдроза непарного шелкопряда. На 7-й день отбирали по две пробирки каждого разведения вируса ядерного полиэдроза и учитывали общее количество клеток в каждой пробирке. Подсчет клеток производили в счетной камере Горяева с точностью + 1-3 10 клеток/мл. Учет на более поздние сроки производили с целью установления возможного прироста клеток в пробирках с низкой множественностью заражения. К этому времени количество клеток в контрольной культуре увеличивалось в несколько раз,что обеспечивало более четкое определение разведения, дающее эффект подавления роста клеток. Результаты учета показали, что вирусосодержащии материал в разведении 10 еще подавля-7 ет рост клеток, тогда как разведение . 10 таким эффектом не обладает.
Концентрацию вируса выражали в условных единицах подавления роста клеток на 1 мл зараженной клеточ1104 155
Метод титрования
Система
Титр по ПРК
ЕПРК/мл
Титр по бляшкам, БОЕ/мл
T,Т
4.105
2 10
Составитель И. Тареева
Техред М. Гергель
Редактор Н. Джуган
Корректор О, Билак
Заказ 5166/18
Подписное
Тираж 522
ВНИИПИ Государственного комитета СССР . по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ной сус пензии — ЕПГК/мл. За единицу активности принималось минимальное количество вирусосодержащего материала, которое еще вызывало подавление роста клеток. Так, для вируса ядер- 5 ного полиэдроза тутового шелкопряда титр составлял 10 ЕПРК/мл. Сравнивали результаты титрования по ПРК с данными титрования по бляшкам. Титр вируса ядерного полиэдроэа тутовОго
Х шелкопряда по бл яшкам с оставлял 4 ° 10 бляшкообразующих единицу на 1 мп. Таким образом, для данной системы: вирус ядерного полиэдроза тутового шелкопряда — клетки непарного шелкопряда 1э
SCLd-135 чувствительность титрования по ПРК примерно на порядок выше, чем по бляшкам.
Аналогичные результаты получены при титровавии вируса ядерного поли- 20 эдроза большой вощинной моли, вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда. Для этих вирусов титрование по ПРК также оказалось более чувстКлетки SCL d = 135 — вирус ядерного полиэдроза тутового шелкопряда
Клетки БС1. д = 135 — вирус ядерного полиэдроза большой вощинной моли
Клетки 1Р1. В = 65 - вирус ядерного нолиэдроза непарного шелкопряда вительным, чем другими методами (см. таблицу). Сравнение чувствительных трех способов титрования вирусов ядерного полиэдроэа приведено в таблице.
Поскольку вирус ядерного полиэдроза непарного шелкопряда в культуре клеток непарного шелкопряда 1Р1, В-652не образует бляшки, а погиэдры образуются только в единичных клет-2 ках начальных разведений (10 — 10 ), титр этого вируса ядерного полиэдроэа определяли только по методу ПРК.
Результаты проведенных опытов вос" производимы для всех испытуемых систем. Из приведенных данных можно сделать вывод, что предлагаемый способ титрования;энтопатогенных виру" сов в культуре клеток насекомых позволяет определить инфекционность широкого круга вирусов, т.е. всех тех вирусов, которые при размножении в культуре подавляют рост клеток, не вызывая их разрушения.
