Способ определения диуретической активности вещества

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИУРЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВА, включающий воздействие препарата иа биологическую мембрану с последующей регистрацией электрической характеристики, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, воздействуют на мембраны клеток харовых водорослей , фиксируют потенциал на мембране , измеряют амплитуду переходно-. го тока мембраны и по уменьшению амплитуды тока определяют диуретическую активность вещества. (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СВМФП ФМ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„111 918 ур . G 01 N 33/48 вские>з»>

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ И

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

flO ДКЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОЗНРЫТИЙ

- (21) 3524972/28-13 (22) 20.12.82 (46) 15.10.84. Бюл. М 38 (72) О.M.Æåðåëoâà,! .Н. Берестовский, Ю.В.Наточин И А.А.Катаев (7!) Институт биологической физики

АН СССР (53) 6!6.07 (088.8) (56) 1, Muschoweck Won R,und Ha)du.P.

Die еа1Ы1цгеййэсЬе 1>1irksamkel

der chlor-N-(2-furylmethy)-5-sulfamy-anthranil-sare. Arzneimittel-Forschung, .1964, N I>,S 44-47.

2.И.Burg, L.Stoner,. J.Cardinal

and М.Green.Furosemid effect on isoiaсей perfused tubules. — Amer.J. of

Physiol,, 1973,.U.225, 11> 1, р.р, !

19-124 (прототип). (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИУРЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВА, включающий воздействие препарата на биологическую мембрану с последующей регистрацией электрической характеристики, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, воздействуют на мембраны клеток харовых водорослей, фиксируют потенциал на мембране, измеряют амплитуду переходно-.

ro тока мембраны и по уменьшению амплитуды тока определяют диуретическую активность вещества.

111893 8

Изобретение относится к технике отбора фармакологических препаратов и может быть использовано в фармакологической промышленности для отбора диуретических препаратов, широко используемых в медицине .

Известен способ испытания диуретиков путем перорального или внутривенного введения их животным (собакам, кроликам, крысам) и человеку с пос- fO ледующим анализом суточного диуреза и электролитного состава мочи (калий и натрий определяют методом пламенной фотометрии, хлор-потенциометрическим титрованием) (1 3 l5

Недостатком известного способа является невысокая специфичность отбора, так как введенный "per os" препарат действует на весь организм в целом и действие его на поперечньГе 20 канальцы может быть опосредованным.

Кроме того способ характеризуется большой длительностью опытов, иэмеряющейся сутками, и большим расходом испытуемого вещества, вводимого 25 иэ расчета на килограмм веса животного.

Известен также способ отбора диуретиков, включающий действие диуре- З0 тика на мембранную систему перфузированных почечных канальцев с последующим анализом солевого состава пропущенной через каналец жидкости без диуретика, а затем с испытуе- 35 мым диуретиком. Почечные канальцы выделяют иэ изолированной почки жи1Ф вотного. Через просвет канальца с определенной скоростью прогоняют солевой раствор, который вводят в ка- 40 нап между двумя каплями масла без диуретика и с испытуемым веществом.

После продвижения раствора через каналец на выходе последнего собирают его содержимое, находящееся между 45 двумя каплями масла, в микропипетку и определяют электролитный состав на пламенном фотометре, содержание хлора — электрометрическим титрованием или же с помощью радиоактивных 50 изотопов. Потерю воды иэ просвета канальца определяют по изменению концентрации введенного в перфуэируеьый раствор инертного вещества †инулина. Способ является более специфичным, так как действие испытуемого вещества направлено непосредственно на функцию почечных канальцев (21.

Недостатки укаэанного способа— трудоемкость, техническая сложность выполнения опытов и анализа состава внутриканальцевой жидкости, большая длительность. В данном случае также необходимо использование животных.

Целью изобретения является ускорение способа определения диуретической активности веществ.

Поставленная цель достигается тем, что по способу определения диуретической активности вещества,включающему воздействие препарата на биологическую мембрану с последующей регистрацией электрической характеристики, воздействуют на мембраны клеток харовых водорослей, фиксируют потенциал на мембране, измеряют амплитуду переходного тока мембраны и по уменьшению амплитуды тока определяют диуретическую активность вещества.

Способ осуществляется следующим образом. .В камеру из оргстекла, состоящую из 4-х отсеков а 0 е ь, соединенных между собой желобками, помещают клетку и отсеки заполняют вазелином для изоляции рабочего участка клетки (длиной 1,5-2 мм), находящегося в отсеке b . .Отсек з служит для улучшения изоляции и раствором не заполняется. Отсеки и g заполняют раствором следующего состава: 0,1 ьИ КС1;

l0 мМ NaCI; рН 7,0; отсек h - солевым раствором: 0,1 мМ КС1 10 мМ NaC1; мМ CaCl, 100 мМ сахарозы.Трис-буфер рН 7,6-7,8. Исходный раствор в отсеке 6 заменяют в ходе опыта раствором, в который добавлено испытуемое вещество. В камеру вводят измерительные потенциальные электроды.

Электроды подключают к системе фиксации.потенциала на мембране клетки, Пример 1. Определение специфического воздействия лаэикса в концентрации 1 5 ° 10 М на хлорные каналы мембраны.

Испытания проводят на интериодальных клетках харовых водорослей, предварительно выдержанных 2-3 сут в солевом растворе следующего состава:

0,1 мМ KCl lO мМ КаС1; мМ СаС12.

Трис-буфер рН 7,6-7,8. Берут клетку, слегка ее подсушивают фильтровальной бумагой и переносят в экспериментальную камеру, желобки которой предварительно заполнены вазелином для иэоля18

Составитель С.Котелевцев

Редактор И.Рыбченко, Техред JI.Êîöþáíÿê

Корректор И.Эрдейи

Заказ 7444/31 Тираж 822

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., д.4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент", r.Óàãoðîä, ул.Проектная, 4

3 11189 ции рабочего участка клетки. После того, как клетка слегка теряет тургор, отрезают концы клетки и заполняют отсеки а и последовательно раствором, содержащим 150 мМ KCl; 10 мМ

NaC1 рН 7,0. Процедуру заполнения отсеков а и проводят под контролем бинокулярной лупы, следя за тем,чтобы проток жидкости через клетку из отсека м в отсек ъ или наоборот был 10 минимальным и не превышал скорости движения цитоплазмы в клетке. Отсек

6 заполняют раствором, содержащим

О,1 мМ КС1; 1О мМ NaC1 IмМ СаС12, 100 мМ сахарозы. Трис-буфер РН !5

7,6-7,8. Подключают установку фиксации потенциала Й регистрирующие приборы, фиксируют на мембране клетки потенциал и ведут обычный эксперимент снятия вольт-амперных характе- 20 ристик. После снятия контрольной вольт-амперной характеристики в нормальных условиях исходный раствор в отсеке 6 заменяют раствором,содер-5 жащим лазикс в концентрации 1,5 IO M 25 и в этих условиях снова снимают вольтамперную характеристику. Амплитуда токов значительно падает, и характер вольт-амперной характеристики отражает ингибирующий эффект лаэикса на 30 хлорные каналы мембраны.

Пример 2. Определение специфического Воздействия современного диуретика ДТ-327 в концентрации 25 мг.

УслОвия Выполнения те.же чтО ы В 35 примере 1. Характер поведения вольт-. амперной характеристики отражает специфическое ингибирование хлорных каналов мембраны веществом ДТ-432.

Пример 3. Определение специ- 40 фического воздействия ртутного диуретика-новурита в концентрации

2,3-10 М. Условия выполнения те же, что и в примере I.Изменение вольт-, амперной хаРактеРистики отРажает 45 ингибирующий эффект новурита на хлорные каналы мембраны клетки.

Пример 4. Определение ñïåцифического воздействия ртутного диуретика меркузала в концентрации

2 10 М. Условия выполнения те же, что и в примере 1. Меркузал подавляет токи, но В отличие от других диуретиков смещает потенциал реверсии тока к нулю, т. е. нарушает хлорную из бир ательность мембраны. Кроме того,под воздействием меркузала наблюдают повреждение мембрайы клетки, что проявляется в скачкообразном нарастании тока при постоянном напряжении на ней вплоть до необратимого повреждения мембраны. Повреждение клетки

{плазмолиз) можно наблюдать под бинокулярной лупой.

Полученные. данные свидетельствуют о необратимом повреждении клетки и о непригодности данного диуретика в качестве лекарственного препарата (в настоящее время меркузал снят с производства).

Использование предлагаемого способа по сравнению с известным позволяет — увеличить специфичность ïåðвичного отбора испытуемых препаратов поскольку испытуемый препарат оказывает воздействие иепосредственно на иойные каналы мембраны клетки, исключает длительный путь препарата в организме животного . от всасывания в пищеварительном тракте до места его действия — клеток почечных канальцев; исключить необходимость использования экспериментальных животных при первичном отборе препаратов; значительно сократить время единичного испытания (От часов и суток до

30 мин и 1 ч);уменьшить расход испытуемого препарата, так . как объем отсека камеры, s котором находится рабочий участок клетки, можно ограничить 1-2 мл раствора; упростить процедуру отбора, используя простое по конструкции и удобное устройство.