6-гексадеканоиламино-4-метилумбеллиферил- @ - @ - галактопиранозид в качестве флуорогенного субстрата для определения активности галактоцереброзид- @ -галактозидазы

 

б-Гексадеканоиламино-А-метилумбеллиферил- -D- галактопиранойид СНз-(СНг),гОС-НЫ Gal-j3-0 в качестве фпУорогенного субстрата с для определения активности галактоце- S рёброзид-&,-галактозида9ы (КФ 3,2,1, /А

(19) (И) СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕО.(ИХ

РЕСПУВЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ,1 (i

1 с, I

СН3-(СНг)И OC HN ("-at — )3-О

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОП.() РЬ)ТИЙ (2 1) 3582101 /23-04 (22) 10.03.83 (46) 23.05.85. Бюл. 1(р 19 (72) И. К. Козлова, Г. Я. Видершайн и Г. С. Ильина (71} Институт биологической и медицинской химии AMH ÑÑÑÐ (53} 577.154.1 (088,8) (56} 1. Vanier H. Т. et al. "Prenatal diagnosis of Krabbe disease", Clin. Genetics, 20, 79-89, 1981

2. Gal А; E. et al "А practical

chromogenic procedure for the diagпози of Krabbe з disease". Clin.

Chim. Acta, 77, 53-59, 1977.

3. Shan М. И., Mehta D. Н.

"Nitration of 4-.metylumbdifегоne. .

and there methyl esters, J. Indian

СЬев. Soc. 31, 784-786, 1954, 4. Nehta R. Н., Setha S. "Beckmann

Rearrangement of the oximea of the

Some С-Acyl-coumarins", J. Indian

Chem. Soc., 4)., 122-124, 1964.

5р Видершайн Г,Я. Биохимические основы гликозидозов. И., Медицина

1980.

4(5() С 07 Н 17/06) А 6) К 3)/35 (54) 6-ГЕКСАДЕКАНОИЛА))ИНО-4-ИЕТИЛУИБЕЛЛИФЕРИЛ- I) -D-ГАЛАКТОПИРАНОЗИД, В КАЧЕСТВЕ ФЛУОРОГЕННОГО СУБСТРАТА

ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ГАЛАКТО

ЦЕРЕБРОЗИД. У -ГАЛАКТОЗИДАЗЫ, (57) 6-Гексадеканоиламнно-.4-метнлумбеллиферил-В -Р-, галактопиранозид

°,, l

СН в ха (естве фауорогенного субстрата для олределенитя активности галактоце. З

1 рввравва-р.-тваввтоввдавй (КФ 3.2.l. N

1119334

Изобретение относится к области органической химии и конкретно касается нового производного 4-метилумбеллиферил" 5 "галактопиранозица, которое обладает свойством флуоро" генного субстрата для определения активности галактоцереброэид ",P -ra" лактоэидаэы (Gal-cer" -Gal

КФ 3. 2. 1,461 и может найти применение в диагностике одного иэ наследст" 10 венных гликолипидазов - болезни

Краббе, развивающейся при недостаточности укаэанного фермента.

Известно использование в качестве субстрата для определения активности и специфичности Gal-cer- ))Gal природного(оН-С -галакто)-цере" брозид- Р "галактопиранозида с радиоактивной меткой (1) . Недостатком использования природного субстрата 2п является дороговизна, сложность получения и нереальность применения в настоящее время в условиях кликики из-за отсутствия дорогостоящего оборудования. 25

Наиболее близким па структуре к описываемому соединению является 2-гексадеканоиламино-4-нитрофенил- Э—

-D-галактопираноэид (HNGal)„ который был использован в качестве субстрата30 для определения активности Саl-cer" -Gal и предложен для диагностики ..болезни Краббе (2 . Недостатком применения HNGal нвлнетсн низкая специфичность и чувствительность: при ап35 ределении активности Gal-cer- P —-,,Gal c использованием в -качестве субстрата

ИНСа1 ферментный препарат из лейкоцитов или кожных фибробластов должен содержать 0,2"0,6 г белка, т.е. в

10"20 раэ бальще, чем в случае природного субстрата с радиоактивной меткой 111. Сложность получения такоГо большого количества ферментнога .препарата крайне затрудняет применение И?1Са1 как субстрата для определения активности фермента, особенно в случае пренатальной диагностики болезни Краббе.

Цель изобретения - новое производ. ное 4-метилумбеллиферил-P "D-галактопйраноэида. которое обладает свойством флуорогенного субстрата для определения активности Саl-cer"p --Са1у и применение которого повышает чувствительность и специфичность метода определения активности фермента. о

Поставленная цель достигается 6-гек садеканоиламино "4-ме тилумбеллиферил- P -D-галактапираноэидом обладающим свойством флуорогенного субстрата для определения активности Gal"cer-P -Gal.

Способ получения описываемого соединения заключается во взаимодействии 4-метилумбеллиферона с солью нитронин, восстановлении полученного 6нитропроизводнаго до соответствующего амина, ацилировании последнего хлоран!Hplýидам пальмитинаваи кислаты9 гликазилировании продукта ацилированин с -бромтетраацетатом Э-галактазы и деацетилировании полученного ацетата галактазида 1.21, П р и и е p l. К суспензии 5 г

4-. метилумбеллиферона (1) в 50 мл абс.

ИеСИ при О С и перемешивании добавляют порциями 3,7 г тетрафторбората нито рония, перемешивают при О C 30 мин„ осадок Отфильтровывают, перекристаллизавывают из 125 мл смеси EtOH-ИеИО (l:4) . Получают 3 г (607) 6-нитра-4-метилумбеллиферона (11), т.пл. 257260 С. Т.пл. пробы смешения с заведомым образцам, полученным по j3), 257 С . М 0,5 (силуфол, EtOAc-СНС1

1:15).

К суспензии 5,5 r (II) в 30 мл

257-ного водного раствора NH> прили" вают 30 мл насыщеннага при 20 С водного раствора дитианита натрия, кипятят 15 мин, охлаждают и отфильтро" вывают осадок. Получают 4,6 г (977) б.-амина-4-метилумбеллиферана (ЕЕЕ), О т.пл. 272 С. Согласно (4), т.пл.

273 С. Rl 0,85 (силуфол, MeOH) °

К раствору 3,6 г (III} в 90 мл сухого .пиридина при перемешивании добавляют 9 мл хларангидрида паль" митинавай кислоты, перемешивают при

20 С 3 ч, приливают 50 мл HeCN ocaдок отфильтровывают, перекристаллизавывают иэ 75 мл смеси СНС "ТГФ 1,1 получают 8 г (987) 6-гексадеканоиламино-4-ме гилумбеллиферона (IV), т. пл.

131 С. Rf 00,67 (силуфол EtOH-СНС1

1 1}. ИК-спектр, см : 3390 (NH), 1700 (СО). Максимум флуоресценции

415 нм при 3ь, „. 342 нм.

3 111 9

Натриевую соль (IV) получают до-,, бавлением эквимолярного количества

EtONa в 10 мл Е ОН к раствору 8 r (IV) в 50 мл сухого ТГФ, концентрируют и отфильтровывают Na-соль, вы- .5 ход 100%., т,пл, 280 С. Иаксимум флуоресценции 450 нм при ),, 387 нм. УФ-спектр; h, 390 нм, E - 1284О(тГФ).

К суспензии 1 г На сох и (ХЧ) в

50 мл сухого ТГФ добавляют раствор

0,85 r с -бромтетраацетата D-галактозы в 10 мл. смеси ТГФ Ие SO (1:1}.

Смесь кипятят 22 ч, фильтруют, упа" ривают, приливают 120 мл воды и экст- 15 рагируют 100 мл СНС1, Зкстракт сушат над CaCg, упаривают, остаток д 2 растворяют в Et О и фильтруют чед рез 2-х сантиметровый слой силикагеля, фильтрат упаривают, Получают 20

1,1 r (65%) б-гексадеканоиламино-4-метилумбеллиферил" P "D-О-тетраацетилгалактопиранозида (V), т,гч, . 69 С. 1<„E 0,65 (силуфол, СНС .„ -NeOH

9: Ц . ИК"спектр,. см : 3420 (ИН), 25

1760 (СО), 1240 (Ас-OR).

К раствору 0,4 r (V) в 10 мл абс, MeCN приливают 0,12 мл 0,5 М раствора

ИеОМа в 10 мл абс. ИеОН, выдерживают при 20 С 36 ч, осадок отфильтровывают,30 перекристаллизовывают .из EtOH, Получают 0,18 r (58%) б-гексадеканоиламино-4-метилумбеллиферил" р --галактопи" ранозида (HMGal), т.пл. 204"205 С.

Rf ОO,24 (силуфол, СНСй -Ие CO 1:! 1, д5

Иаксимум флуоресценции 413 нм при

312 нм. ПИР-спектр, Brucker-250, (зLSS©9 д (ф )

1,55 (9-СНд алиф..).,- 2,3 (аром, СН ), 4,82 дубл., j = 8 Гц (с -аном. Н при 4о

С1 галактозы, 3,4"3,7 мульт, (Н галактозы), 6,24, 7,13, 8 43 сингл. (H дО О аром.) . E Jq = -19 С pl%-ный раствор в (СН } SO) ..

Пример 2 1Ьубационная 4$ смесь (0,1 мл) .содержит 0,25 мв неочищенного таурохолата натрия, 15 мкг

:олеиновой кислоты, 25 мкл цитратного буфера (рН 4,5)„ 15-30 нмоль Ж10а1, 30-100 мкг белка ферментного прелата 50

334

Активность ферментов выражена s нмолях расщепленньм субстратов эа

1 ч на 1 мг белка. В квадратньм скобках - число определений; в кругльм скобках — пределы колебаний активностей; н.о. - активность фермента с указанным субстратом не определяется. !

Использование ЕИа1 в качестве .флУорогеннаго субстрата для определения активности Gal-cer.- f "Gal обеспечивает на порядок более высокую чувствительность метода, чем его структурный аналог NHGal и более высокую специфичность. !

Соединение по изобретению дает возможность проводить диагностику болезни Краббе и выявлять гетерози» готных носителей этого заболевания по унифицированным методам выявления других лизосомных болезней накопления, при которых недостаточность какого — либо фермента устанавлива- ", етсл с помощью субстратов — производных 4 — метилумбеллиферона j5) ф та из лейкоцитов или кожньм фиброблас. тов человека, Время инкубации составляет 4-6 ч при 37 C. Ферментную реакцию останавливаюг добавлением 0,7 мл смеси Et0H-глициновый буфер (рН 10,5)

5:2, Количество расщепленного HMGal рассчитывают относительно флуоресценции стандартной концентрации (IV) в смеси EtOH-глициновый буфер (рН 10,5), 5:2 ° Активность достигает максимума при насыщении HMGal 70 нмаль в пробе, К1Ч," 0,071. В таблице приведены дайные по сравнительному определению активности Gal-cer-p -Gal и Ощ1 - Р-галактозидаэы (G t - 9 -Gal, КФ 3. 2. 1. 23 в лейкоцитах и кожных фиб" робластах в норме при G -ганглиоэидозе (недостаточность С„,," P -Gal) и в случае предполагаемой болезни Краббе с использованием в качестве субстра".

-.ов HMGal, HNGal и 4-метилумбеллифе" рил- P -D"галактопиранозида (MGal). б 1119334

Активность Gal-car"P -Gal и Сц, -. Р -Gal в культивированных фибробластах кожи и лейкоцитах человека в норме и при некоторых гликолинидозах

Активность С, — 5 ""Gal

MGal

Источник фермента

Активность Са1-car- P -Gal субстраты

HMGal

HNGal

1 ф 05 (2j 2ф 07 Г2) (0,9-2,2) (1, 99-2, 14) 0,06 (11 0,00 01

Болезнь Краббе

Лейкоциты

325 (53 (144-584) Норма

1 ° 10 (Я 2 17 Ul (О, 61-2, 06) (1, 68-3, 53) С, -ганглиозидоз

Больные

0 9 1.31 1,75 Г1.1 (Ов57 1в25) О, 75 43 н.о. (0,56-0,89) 96,1 (41 (80,8-135,4) Родители

Составитель Ю. Голова

Редактор П. Горькова Техред M. Пароцай Корректор С. Шекмар

Заказ 2900/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная 4

Фибробласты

Норма

308 (2) (168-447)

256 К

4,00 (3) (2,30-5,04) Тир.аж 354 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5