Способ получения квадрациклического лактона,обладающего противоопухолевой активностью

 

ОПИСДНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕ ТУ

Союз Советских

Социалистических

Респубиик 1969140 (6! ) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 30. 03 ° 79 (21) 2747552/28-13 (28.07.78) (РСТ/US 78/000 58) (23) Приоритет - (32) 02.08.77 (51) М. Кл.

A 61 K 31/33

Гасударственный квкитет (3I ) 821087 (33) США

Опубликовано 2 3. 1 О. 82 . Бюллетень ра 39

Ссср во лехам кзюбретенкй и вткрытий (53) УДК 615 ° 771..7(088.8 ) Дата опубликования описания 23. 10,82

Иностранцы

Гейри Джин Калтон, Иарлин Альвин Эспе и Ричард Лес Раниери (США) . (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

"В;Р.Грейс энд КО" (США) (71) Заявитель

У (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КВАДРАЦИКЛИЧЕСКОГО ЛАКТОНА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ

У а О

О 3 5

Изобретение относится к химикофармацевтической промышленности и касается получения лекарственных препаратов.

Целью изобретения является получение квадрациклического лактона формулы обладающего противоопухолевой активностью.

Цель достигается тем, что штамм

Aspergi1Ius terrens NRRL 11156 куль-. тивируют в аэробных глубинных условиях при, 22-30 С в течение 4-15 сут. в питательной среде, содержащей углевод, белковую основу и сернокислое железо, и выделяют целевой продукт из культуральной жидкости.

При этом. культивирование проводят при 25 С в течение 12 сут.

Штамм Aspergi l lus terrens, используемый для получения квадрациклического лактона выделен из образца почвы из Типперари, Северная территория, о Австралия и хранится в коллекции

Сельскохозяйственной научно-исследовательской службы США, Отделение по научным исследованиям и развитию для использования в северных районах Министерства земледелия США г.Пеория, шт.Иллинойс под номером

NRRL 1I156.

Иорфологические признаки. Конидиальная голова столбообразная 25-50< х 100-175. мкм, однородная по диамет" ру. Очень молодые головы с 1-5 конидиями в цепи, сферичны по форме, с приближением зрелости становятся столбообразными.

3 969140

Конидиофоры гладкие 4-5pl х 150200,р .

Пузырьки диаметром 7-17 мкм, сферичные, некоторые со слегка грушеобразным контуром.

Стеригмы имеют размер первичной серии 5.-6 х 2-3 мкм, форма пузырьковая.

Конидии сферообразной формы с гладкой стенкой, диаметр 2-2,5 мкм. 10

Культуральные признаки после 8 дней роста при 25 С: замачивающий водяной агар: размер колонии 30-35 мм, коричневато-желтом °

ro цвета; 15 картофельно-декстрозный агар: размер колонии 25-40 мм, коричневато-желтого цвета; декстрозный агар Сабуро: размер колонии 50-60 мм, желтовато-корич- 20 невого цвета; солодово-дрожжевый агар: размер колонии 40 мм, желтовато-коричневого цвета.

Способ осуществляют следующим образом.

Штамм Aspergi l lus terrens NRRL11156 культивируют в аэробных глубинных условиях при 22-30 С в питательной среде, содержащей углеводбелковую основу .и сернокислое желе5 зо. силикагеля и другими системами раст25 ворителей (аминокислоты и другие соединения, содержащие азот ). ферментация .проходит в аэробных глубинных условиях.

Микроорганизмы в ходе ферментации

Эв в водной среде находятся в суспензированном состоянии. При аэробной ферментации, сбраживаемая среда перемешивается для введения в нее воздуха. Это достигается как простым перемешиванием, так и барботироваЭ5 нием воздуха. Воздух перемешивают от 100 до 400 об/мин. Воздух можно продувать через культуральную жидкость в количестве 0,025-1 объема воздуха в 1. мин на 1 объем среды, 40 т.е. коэффициент аэрации соответствует О, 025: 1. Скорость аэрации можно увеличить для того, чтобы добиться максимального выхода.

Квадрациклический лактон выделяют из культуральной жидкости посредством экстрагирования растворителями, например н-бутанолом, хлороформом, этилацетатом, диэтиловым эфиром и тетрагидрофураном.

5Ь

После экстрагирования квадрациклический лактон отделяют от экстракта известными способами, например экстракт можно,упаривать досуха и лактон можно повторно растворить и кристаллизова ть из метанола (воды или других систем растворителей ), можно использовать и другие системы, Подходящими источниками углеводов являются меласса, кукурузная патока, глюкоза, сыворотка, растворимый крахмал из кукурузы, картофеля, соя (и другие бобовые ), кассава, бананы и зерно.

Подходящими источниками азотсодержащих питательных веществ являются протеины, например, содержащиеся в муке соевых бобов, кукурузы, зерна и семян хлопка, отрубях, дрожжевых экстрактах, мясных экстрактах (из говядины, свинины, рыбы, курицы), рыбной муке, молочных продуктах (казеина снятого молока) и в их продуктах распада.

Кроме метода экстрации растворителем применяют и другие методы для того, чтобы выделить лактон из культуральной жидкости. Можно, например, пропускать культуральную жидкость через макромолекулярную (полистирол) дивинилбензоловую смолу. Примером такой смолы является ХАД-2 с пористостbe по гелию 40 о6.3, удельной поверхностью 300 м /г и средним диамет2 ром пор приблизительно 90 10 в см.

Лактон сорбируется поверхностью смолы,,после чего его удаляют посредством десорбции низшими цпйртами, например, метанолом или водометанольными растворами.

Квадрациклический лактон можно выделить методом тонкослойной хроматографии. Лактон может быть обнаружен методом использования модифицированного реагента, проявляющего светлое желтое пятно с Rf = 0,6-0,7.

После этого экстракт лактона в растворителе подвергают хроматографии на пластинке силикагеля. Кристаллы лактона получают вымыванием метанолом (или аналогичными растворителя.- . ми) из кремнезема и последующего выпаривания метанола до получения насыщенного раствора. Раствор подвергают медленному охлаждению, в течение которого образуются кристаллы.Лактон можно вымывать из пластинок

Во вреия обеих стадий инкубирования используют достаточное количество, блок-.сополимера оксиэтиленого. оксипропиленового ("Р1uronlc PL-61") для того, чтобы свести пенообразование до минимума. Как правило, количество поверхностно-активного вещества составляет 0,154. На второй стадии инкубации бульон непрерывно перемешивают со скоростью 350 об/мин, Кроме того, через бульон продувают воздух в количестве приблизительно

2 л/мин.

5 96914 например этанол (вода, метанол, этанол, хлороформ ), циклогексан, цикло гексан или этилацетат, например, этанол или хлороформ..

Кристаллы могут быть получены и 5 другими методами, например экстракт метанола может быть выпарен, а полу ченный материал повторно растворяют в системе метанол/вода с последующим охлаждением для образования кристаллов.

Квадрациклический лактон, полученный предлагаемым способом, представляет. собой вещество с молекулярным весом 248,14 18, определенный масс-спектральным методом. Это соот-. ветствует эмпирической формуле

С„ H2003

Инфракрасный спектр показывает адсорбцию при 1745 см ", что указы- 20 вает на присутствие пятичленного кетона или -лактона, и при 1 390 и

1375 см ", что указывает на присутствие двойной дииетиловой группы.

Ультрафиолетовый спектр лактона пока- 25 зывает слабую абсорбцию при 280 нм.

Протоновый спектр ЯМР подтверждает присутствие двойной диметиловой группы с двумя 3-протонными синглетами при 6 1,24 и 1,28. Двух-,однопротон- зв ный дуплет дуплетов, центрированных при с 4,23 (= 12,5 Гц ) и 4,65 — 12,1 Гц ), характерны для не эквивалентных протонов метилена, примыкающих к о -лактоновому кольцу.

Пример 1. Производство квадрациклического лактона.

Лиофилизованный образец Азрегц11- .

lus terreus(NRKLH<11165) растворяют в 2 мл 24-ного раствора солодового экстракта. Полученную суспензию намазывают на поверхность косого картофельно-.декстрозного агара, размером 16xl25 мм, и подвергают.инкубации при 30 С в течение 7 дней. По4S лученную культуру суспендируют в

10 мл воды с тем, чтобы получить суспензию, содержащую около 10 10" спор/ил 20 мл приготовленной суспензии используют для того, чтобы их инокулировать .в 1 л среды, находящейся в четырехлитровом сосуде. Состав среды следующий, г/л:

Глюкоза 40

Мука хлопковых семян 3

Мука из ростков кукурузы 1

Масляная мука из сои 1

КНРО„ 1

Мо50„7Н О 1

FeS0, ° 7H 0 0,01

СаСОз

NaC1 0,5

К этой среде добавляют достаточно деионизированной воды для того, чтобы получить 1 л бульона. После инокулирования бульон подвергают инкубации при 25ОС в течение 3 дней при посто- . янном перемешивании(250 ob/ìèí ).

2 л этого бульона используют для инокуляции 20 л бульона. При этом мукой из кукурузных ростков или соевой мукой не пользовались, а количество FeS04 -7Н О сокращено до

0,001 г/л, Таким образом,единственным источником азота является мука .из семян хлопка, рН бульона устанавливают равным 6,9-7,1 и инкубируют при 25оС. Через 7 дней конечный рН составляет 6,0-6,5. Кроме того, бульон содержит 0,5-2 вес.Ф глюкозы.

fl p и м е р 2. Выделение квадрациклического лактона. .Фильтруют 20 л выработанного бульона для того, чтобы удалить мицелиальную массу (около 1 л ). В фильтрат вводят 4 равные части н-бутанола в объемном отношении 4: 1. Таким образом, лактон, раствореннный в н-бутаноле,выделяют из среды; после соединения экстракты в н-бутаноле упаривают досуха над водяной баней при 40ОС (приблизительно 1 мм/Hg i посредствам тонкопленочного роторного испарителя. Полученную смолу рас" тирают с 0,5 л хлороформа, который затеи отгоняют с паром. В результате получают густое коричневатое масло.

Это масло растворяют в смеси метанола и воды, из которого кристаллизуют кристаллы лактона с помощью затравки.

Используя описанную методику, выход лактона составляет примерно 0,2 мг/мл исходного ферментативного бульона. формула изобретения

ВНИИПИ Заказ 8195/81 Тираж 714 Подписное филиал ППП "Патент", r ° Ужгород, ул.Проектная, 4

7 96

Дальнейшая перекристаализация иэ метанола/воды дает продукт максймальной чистоты. При этом выход квадрациклического лактона в этих случаях превышает 0,1 мг/мл .

Пример. 3. Выделение лактона методом препаративной тонкослойной хроматографии.

Коричневое масло из примера 2 на.носят полосами на силикагелевую пластину размером в 20х20 мм (толщиной

1 мм ). В качестве проявителя применяют хлороформ/метанол в отношении

9: 1. Проявление производят при комнатной температуре. Визуализацию про. водят смесью п-анисальдегида, серной кислоты, уксусной кислоты и этанола (в пропорции 0,5:0,5: l:9), которая наносится распылителем при нагреве до 43 С (110оЕ) до тех пор, пока не достигают максимальное проявление всех цветов. При проявлении лактон образует яркое желтое пятно. Затем лактон выделяют с помощью других пластин, применяя известный метод.

Лактон...выделяют из силикагелевых пластин посредством суспензирования соскобов в метаноле, фильтрования, упаривания досуха с последующей кристаллизацией из метанола/воды. Повторную кристаллизацию из метанола/воды осуществляют, по крайней мере, один раз. Выход лактона при использовании метода тонкослойной хроматографии достигает не менее 0,01 мг/мл.

Пример 4. Токсичность квадрациклического лактона.

Кристаллы квадрациклического лактона суспендируют в карбоксиметилцеллюлозе (10 мг в 1 мл ) и делают инъекции мышам при различных дозах.

Дозы до 340 мг на 1 кг веса животного не вызывают смертельного эффекта.

Пример 5. Активность против опухолевых клеток.

Получают опухолевые носоглоточные клетки человека, известные под. названием клеток КВ. КВ-клетки культивируют и инокулируют с различными дозами лактона согласно известной методике. Установлено, что ЕД о рав-. на 1 3 г/мл. В соответствии с описанной экспериментальной методикой

9140 8 установлено, что дозы в 4 мкг/мл и меньше оказываются активными против опухолевых клеток.

Пример 6. Исследования противоопухолевой активности квадрациклического лактона проводят с мышами (штамм ВДГ; самки 18-22 r, группы по 10 животных для каждой дозы вместе с контрольной группой

10 той же численности ) C,ëåro÷íoé карциномой Льюиса. Квадрон растворяют в диметилсульфоксиде (в качестве носителя) и полученный раствор вводят в брюшную полость раз в день, И начиная со дня после имплантации опухоли. Экспериментальной группе животных назначенную дозу дают. раз в день в течение 9 дней. Установлено, что в дозах, превышающих .

go 3,0 мг/кг, препарат активен.

Предлагаемый .способ позволяет получить квадрациклический лактон, обладающий противоопухолевой актив25 ност ью. 1. Способ получения квадрациклического лактона .формулы

40 ф 0

40 О. обладающего противоопухолевой активностью, отличающийся тем,.что штамм Aspergillus terrens

NRRL 11156 культивируют в аэробных глубинных условиях при 22-30 С в течение 4-15 дней в питательной . среде, содержащей углевод, белковую основу и сернокислое железо, и выде-. ляют целевой продукт из культуральной жидкости.

2. Способ no n.1, о т л и ч а юшийся тем, что культивирование проводят при 25 С в течение 12 дней.