Способ диагностики туберкулеза

 

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА , включающий приготовление гистологического препарата, нанесение на него в равных объемах специфической нелюминесцирующей иммунной сыворотки и люминесцирующей сыворотки против глобулинов того животного, от которого получена нелюминесцирующая сыворотка, отличающийс я тем, что, с целью повышения точности диагностики, препарат последовательно обрабатывают неразведенным 2-меркаптоэтанолом и 0,1%-ным раствором пепсина, а нелюминесцирующую и люминесцирующую сыворотки вносят в виде смеси, имеющей концентрацию антител 2:1 соответственно.

СОЮЭ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН зим А 61 К 39100

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3499939/ 28-13 (22) 12.10.82 (46) 30.10.84. Бюл. У 40 (72) Л.К.Суркова и И.В.Коваленко (71) Белорусский научно-исследовательский институт туберкулеза (53) 615 ° 373(088.8) (56) 1. Иммунолюминесценция в медицине. Под ред. Е.Н.Левиной, М., 1977. (54)(57) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА, включающий приготовление гистологического препарата, нанесение на него в равных объемах специйичес..$0„„д ддя8 A кой нелюминесцирующей иммунной сыворотки и люминесцирующей сыворотки против глобулинов того животного, от которого получена нелюминесцирующая сыворотка, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с целью повьппения точности диагностики, препарат последовательно обрабатывают неразведенным 2-меркаптозтанолом и 0,17-ным раствором пепсина, а нелюминесцирующую и люминесцирующую сыворотки вносят в виде смеси, имеющей концентрацию антител 2:1 соответственно.

1 112

Изобретение относится к медицине, преимущественно к средствам лабораторной дифференциальной диагностики туберкулеза.

Известен способ диагностики туберкулеза, включающий приготовление гистологического препарата, нанесение на него в равных объемах специфической нелюминесцирующей иммунной сыворотки и люминесцирующей сыворотки против глобулинов животного, от которого получена нелюминесцирующая сыворотка ° При наличии искомого актигена наблюдают специфическое периферическое свечение в люмикесцентком микроскопе (НИФ) (1) .

Однако известный способ недостаточно точен, так как в срезах тканей или мазках, полученных из тканей больного, препятствием к реакции

НИФ являются фиксированные в тканях иммуноглобулины, блокирующие соответствующие искомые детерминаты антигена. Наличие же блокирующих агентов обуславливает недовыявление иско- 2g мого антигена, что даже в случае присутствия антигенной субстанции возбудителя туберкулеза в исследуемом патологическом материале она не дает специфического свечения, что неизбежно ведет к ошибкам в диагкостике, и туберкулез остается кеидектифицированкым там„ где он присутствует. Кроме того, последовательное двухэталное нанесение специфических иммунных сывороток на исследуемый препарат требует дублирования таких манипуляций, как иккубирование, промывка и высушивание препарата, что делает осуществление способа белее

40 громоздким.

Цель изобретения — повышение точности диагностики.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу диагностики .туберкулеза, включающему приготовле45 кие гистологического препарата. нанесение на него в равных объемах специфической нелюмннесцирующей им»унной сыворотки и люминесцирующей сыворотки против глобулинов того животного.„ от которого получена нелюминесцирующая сыворотка, препарат последовательно обрабатывают неразведенным 2-меркаптозтанолом и 0,17.-ным раствором пепсина, а нелюминесцирующую и люми- кесцирующую сыворотки вносят в виде смеси, имеющей концентрацию антител

2: 1 соответственно.

1008 2

Пример 1. Больной Т,, 42 года. Поступил с жалобами на боли в левом боку, одышку, кашель. Заболел остро в апреле, температура повысилась до 38 . Появились боли в боку. о

Диагностирована пневмония, лри пункции жидкости ке получено. Рентгенологически в левой половине грудной клетки в задне-наружном отделе обнаружена интенсивная овальная тень с выпуклым двойным контуром. Установили левосторонний осумкованный плеврит. Реакция Манту с 2ТЕ отрицательная. Аслирационная пункция плевры: определены лимфоциты, меэотелиальные клетки. Больному произведена плевробиопсия: гистологичесхи определены участки фиброзированкой плевры с элементами продуктивного неспецифического воспаления с преобладанием гистио»л»тов, заключение — хронический неслецифический осумкованный плеврит.

В целях подтверждения неспецифической этиологии заболевания на мазках-отпечатках плевры больного была поставлена реакция непрямой иммунофлюоресцекции (реакция НИФ) предложенным способом. Для этого берут три мазка, один опытный и два контрольных. Опытный мазок помещают в неразведенный "-меркалтоэтанол так, чтобы последний полностью покрыл мазок„ и выдерживают в течение 10 мин при 4 С, после чего вью сушенный препарат помещают аналогичным образом в 0,1-ный раствор лепсика и выдерживают в кем в течение часа при комнатнок температуре. Затем ка высушенный аппарат накосят заранее приготовленную смесь специфических иммуккых сывороток и инкубируют обработакной таким образом мазок в течение 30 мин лри 37 C. После чего мазок промывают одопроводной водой, высушивают ка воздухе лри комнатной темлерутуре и просматривают в люминесцентном микроскопе. При этом наблюдали специфическое (изумрудно-зеленое) свечение ло периферии клеток, на основании чего сделали заключение о присутствии туберкулезного возбудителя в исследуемом материале. Окончательный клинический диагноз: туберкулезньп» осумкованный плеврит. Одновременно для контроля специфичности реакции второй (контролькый) мазок обрабатывают смесью нормальной кро1121008

55 личьей сыворотки и люминесцирующей промышленной сыворотки против глобулинов кролика. При наблюдении мазка в люминесцентном микроскопе отмечали отсутствие специфического свечения. Для контроля самой промышленной сыворотки третий (контрольный) мазок обрабатывают только промышленной люминесцирующей сывороткой. При просмотре мазка в люминесцентном микроскопе отмечали отсутствие специфического свечения. В дальнейшем биопроба с плевральной жидкостью больного оказалась положительной, что подтвердило туберкулезную этиологию заболевания. Диагноз был также подтвержден динамическим наблюдением за больным и положительным эффектом от противотуберкулезного лечения.

В данном случае предлагаемым способом была проведена дифференциальная диагностика туберкулеза и неспе"цифического воспалительного заболевания легких.

Пример 2. Больная П., 20 лет.

Перенесла острое респираторное заболевание с субфибрильной температурой по вечерам. К врачу не обращалась. При флюорографическом обследовании выявлены изменения в легких.

Была госпитализирована с диагнозом диссеминированного туберкулеза легких. Противотуберкулеэное лечение эффекта не дало. В дальнейшем проводилась дифференциальная диагностика между туберкулезом и саркоидозом Бека. При рентгенотомографическом обследовании в обоих легких диффузия мелкоочаговая диссеминация, незначительная деформация рисунка и его избыточность. Предполагается саркоидоз

Бека. Реакция манту 2ТЕ отрицательная. Бронхоскопически: изменения со .стороны бронхиального дерева не выявлены. Пункция внутригрудных лимфатических узлов нерезультативна: в пунктате кровь, лим9оидные элементы. В промывных водах бронхов микробактерии туберкулеза методом посева не выявлены. Больной был проведен торакоцентоз с биопсией правого легкого: в мазках-отпечатках легкого цитологически обнаружены единич.ные эпителиоидные клетки, гистиоциты. макрофаги. Данная цитограмма не позволила убедительно высказаться в пользу саркоидоза.

В целях дифференциации туберкулеза и саркоидоэа больная быпа обсле5

40 дована предлагаемым способом. Для этого берут три мазка-отпечатка из плевры, один опытный и два контрольных. Опытный мазок помещают в неразведенный 2-меркаптоэтанол и вьдержио вают в течение 10 мин при 4 С, после чего высушенный препарат помещают в 0,17-ный раствор пепсина и вьдерживают в нем в течение часа ° Затем на высушенный препарат наносят смесь специфических иммунных сывороток и инкубируют обработанный мазок в течео ние 30 мин при 37 С. После чего мазок промывают водопроводной водой, высушивают и просматривают в люминесцентном микроскопе. При этом специфического свечения не наблюдали. В двух контрольных мазках свечение также отсутствовало. На основании этого туберкулез был исключен. Несколько позже гистологические исследования показали наличие в биопсированной ткани легкого полей фиброэа с единичными эпителиоидно-клеточными гранулемами в стадии фиброзирования без казеоза. На основании результатов обследования больной предлагаемым способом и предположительных данных морфологического исследования больной окончательно выставлен диагноз: саркоидоз Бека, легочная форма, В дальнейшем диагноз был подтвержден положительным клинико-рентГенологическим эффектом гормональной терапии: значительное рассасывание очаговых теней, улучшение общего состояния больной. В данном случае предлагаемым способом была проведена дифференциальная диагностика между туберкулезом и гранулематозным заболеванием — саркоидозом Бека.

Пример 3. Больной К., 43 года. При флюорографическом обследовании выявлены изменения в 52 правого легкого. С диагнозом: опухоль верхней доли правого легкого был госпита. лизирован. При рентгенотомографическом обследовании в верхней доле, правого легкого на границе 9 и bg обнаружен округлый однородный очерченный фокус р.2,5х2 см с тяжистым верхнемедиальным контуром. Трахея, главные и устья долевых бронхов проходимы. Природа патологического образования не ясна. В условиях искус ственного пневмоторакса проведена пункционная биопсия. В пунктуате:

112100Я цитологически опухолевые клетки не выявлены, определяется бронхиальный эпителий, макрофаги, единичные лимфоциты. В мокроте и промывных водах бронхов микробактерии туберкулеза 5 методами бактериоскопии и посева не обнаружены. Опухолевые клетки в мокроте и промывных водах бронхов не выявлены. Вольному была произведена торкаотомия с торакоцентезом справа, биопсией легких с дренированием плевральной полости. Гистологически в пределах биопсированной ткани участки плевро-пневмосклероза, очаговые лимфоидноклеточные инфильтраты„>5 альвеолит.

Цитологически: в мазках-отпечатках легкого обнаружены гистиоциты, макрофаги, лимфоидные элементы.

В целях дифференциации туберкулеза и злокачественной опухоли больной был обследован предлагаемым способом.

Для этого берут мазки-отпечатки легких, один опытный и два контрольных.

Опытный мазок помещают В неразведенный 2 — меркаптоэтанол и выдерживают в течение 10 мин при 4 С, после чего высушенный препарат помещают а 0,1 van раствор пепсина и выдерживают в нем в течение часа. Затем на высу- ЗО шенный препарат наносят смесь специфических иммунных сывороток и инкубирушт обработанный таким образом мазок в течение 30 мин при 37 С. После чего мазок промывают водогроводной водой и просматривают в люминесцентном микроскопе. При этом наблюдали яркое специфическое внутриклеточное свечение. В двух контрольных мазках свечение отсутствовало. На основании результатов обследования больного предлагаемым способом и данных клинико- рентгенологического обследования больному выставлен окончательный диагноз: туберкулема легко-4 го, Впоследствии больной был прооперирован и гистологически диагноз был подтвержден: гомогенная солитарная туберкулема легких.

В данном случае предлагаемым способом была проведена дифференциальная диагностика между туберкулезом и опухолью легкого (онкозаболеванием).

При этом, специфическую, не меченную люминесцирующим красителем, сыворотку к микобактериям туберкулеза получают от кролика по общепринятой методике. Вторая же сыворотка против глобулинов кролика, меченная люминесцирующим красителем, выпускается промышленным способом.

Смесь указанных сывороток приготавливают следующим образом.

К специфической нелюминесцирующей сыворотке микобактериям туберкулеза, полученной от кролика„ в разведении, равном двойному титру, добавляют в эквивалентном количестве промышленную сыворотку с люминесцентным красителем в разведении, равном одному титру, после чего полученную смесь инкубируют в течение 30 мин при 3? С.

Приготовленная таким образом смесь сохраняет свои реактивные свойства в течение 7 дней. Это позволяет с учетом планируемых лабораторных исследований приготовить необходимое количество сывороточной смеси на неделю. Например, если в течение недели проходят обследование 24 больных, а на одного больного расходуют 0,5 мл смеси (0,25+0,25), то общий объем одноразово приготавливаемой смеси составляет 12 мл. Если рабочее разведение промышленной сыворотки составляет, например 1:32, то по ручаемую нелюминесцирующую сыворотку к микробактериям туберкулеза берут в разведении l:16.

Концентрация пепсина в растворе в том виде, в каком она указана в формуле изобретения, выбрана на основании данных, полученных экспериментальным путем (табл. 1).

Как видно из "àáë. Р 1, концентрация 0,1 -ro, раствора пепсина является самой оптимальной, при которой во всех заведомо положительных случаях получено специфическое свечение.

В табл., 1 приведены испытания различных концетраций пепсина.

Соотношение специфической иммунной сыворотки к микробактериям туберкулеза и люминесцирующей сыворотки при

2:1 получено на основании экспериментальных данных (табл. 2).

Как Видно из табл. 2,, соотношение

$÷ÿñòÂующих В реакции сывороток В Ве= личине 2."1 является самым оптималь" ным.„при котором Во всех заведомо положительных 50:.. .:учаях получено внутрнклеточноз свечение.

Предложенный способ В целях дифференциальной риагностики был апробирован у 50 больных, у которых диагноз туберкулеза стоял под Вопросом.

121008 8 таты у 4 больных, а предлагаемый способ у 19, т.е. в четыре раза чаще.

Среди обследованных 50 больных туберкулезный процесс с различной степенью активности бып окончательно клинически диагностирован на основании тесттерапии у 30 больных. Цитологическое же подтверждение диагноза туберкулеза было получено всего у 6 больных.

10 Таким образом, частота выявления специфического антигена туберкулеза предлагаемым -способом в 5 раз превышает известную реакцию НИФ и в 3 раза превышает частоту выявления при

15 цитологическом исследовании.

Предлагаемый способ является эффективным высокоинформативным диаг ностическим тестом и может быть рекомендован для широкого внедрения

20 в практику фтизиатрических учреждений.

Материалом для исследования служили: мазки-отпечатки биопсированной ткани (легких, плевры, лимфоузлы) — 16 больных, пунктаты из плевральной полости — 9 больных, соскобы из бронхов — 26 больных. Изучаемый материал подвергали цитологическому анализу параллельно с исследованием классической реакцией НИФ, т.е. известным и предлагаемым способом.

Результаты проведенных исследований представлены в табл. 3.

Как видно из таблицы, реакция непрямой иммунофлюоресценции (НИФ) была положительной лишь в случаях, когда имел место туберкулезный процесс,. в том числе.и s сочетании с неспецифическими заболеваниями, что свидетельствует о высокой специфичности реакции НИФ. Известный вариант НИФ. дал положительные резульТаблица 1

Результат

Концентрация, Х

Из 50 заведомо положительных мазков флюоресценция наблюдается в 12 мазках.

0 05

0,1

0,2

Свечение не дифференцируется.

0,3

Т а б л и ц а 2 Соотношение сывороток

Результат

Специфическая цельная и люминесцирующая цельная — 1:1

Флюоресценция в 20 из 50 заве»домо положительных препаратов.

Из 50 заведомо положительных мазков внутриклеточное свечение в 50.

Из 50 заведомо положительных мазков флюоресценция в 20.

Специфическая в двойном. титре и люминесцирующая в титре — 2:1

Специфическая в четырехкратном титре и люминесцирующая в титре

4:1

Специфическая в титре, алюминесцирующая в двойном титре — 1:2

Специфическая в.титре, алюминесцирующая в четырехкратном титре -1:4

Диффузное свечение всего препарата

Диффузное свечение всего препата

БНИИПИ Заказ 7841/5 Тираж 687 1Io свое

Филиал ППП Патеит, г.Ужгород, уп.Проектная, 4

Из 50 положительных мазков флюоресценция клеток наблюдается во всех 50 мазках.

Из 50 заведомо положительных мазков флюоресценция наблюдается в 10 мазках.