Способ получения иммуногенных гликопротеинов вируса гриппа

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЕННЫХ ГЛИКОПРОТЕИНОВ ВИРУСА ГРИППА путем обработки очищенного концентрата вируса катионным детергентом цетилпиридинийхлоридом , отделения полученных гликопротеинов и удаления из раствора катионного детергента , отличающийся тем, что, с целью упрощения способа , обработку концентрата проводят при массовом соотношении детергента к белку вирусного концентрата, равном 1,0:1-1,5:1, а отделение детергента осуществляют при температуре 1-4С. i

СОЮЗ СОВЕтСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН з(я) В 61 К 39/145

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ

К ABTOPCH0MV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3486091/28-13 (22) 19.08.82 (46) 15.10.84. Бюл. М2 38 (72) С.А. Медведев, Н.П. Арбатский, Л.М. Лихошерстов, Д.В. Юртов, В.А. Деревицкая, Н.К. Кочетков

Ю.M. Бусыгин, Ю.Ю. Кусов, C.Ê. Мельникова и М.П. Чумаков (53) 612.398 (088.8) (56) 1. Патент С1ИА N - 4158054, кл. А 61 К 39/12, 12.06.79.

2. Патент Великобритании

Ф 1498261, кл. А 61 К 39/18,18.01,78.

„„SU„„118573 A (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЕННЫХ ГЛИКОПРОТЕИНОВ ВИРУСА ГРИППА путем обработки очищенного концентрата вируса катионным детергентомцетнлпиридинийхлоридом, отделения полученных гликопротеинов и удаления из раствора катионного детергента, о т л и ч а ю щ и it с я тем, что, с целью упрощения способа, обработку концентрата проводят при массовом соотношении детергента к белку вирусного концентрата, равном 1,0:1-1,5: 1, а отделение детергента осуществляют при температуре 1-4 С.

Ф 111857

Изобретение относится к микробиологической промышленности, преимущественно к технологии получения противогриппоэной вакцины и касается получения иммуногенных субь5 единиц вируса гриппа — нейтрамини-. даэы и гемагглютиннна.

Известные способы получения иммуногенньгх гликопротеинов вируса гриппа путем обработки вируса неионным 1р детергентом 1 ).

Однако известные способы не позволяют получить высокий выход целевого продукта и предусматривают применение сложного и дорогостоящего оборудования.

Известен способ получения иммуногенных гликопротеинов вируса гриппа путем обработки очищенного концентрата вируса катионным детергентом— цетилпиридинийхлоридом, отделения полученных гликопротеинов и удаления из раствора катйонного детергента (?

Известный способ является сложным 2 и длительным при исполнении, поскольку применяется высокоскоростное центрифугирование и длительная про= цедура удаления детергента в процессе диалиэа.

Цель изобретения — упрощение ciioсоба..

Указанная цель достигается тем,что согласно способу получения иммуногенных гликопротеинов вируса гриппа путем обработки очищенного концентрата вируса катионным детергентом — цетилниридинийхлоридам, отделения полученных гликопротеинов и удаления из раствора катионного детергента тем, обработку концентра- 46 та проводят при массовом соотношении детергента к белку вирусного концентрата, равном. 1,0:1-1,5: 1, а отделение детергента осуществляют при температуре 1-4 С.

Способ выполняется следующим образом.

В суспенэию вируса гриппа в фосфатно-солевом буфере с концентрацией по белку 0,4-1,2 мг/мл добавляют при перемешивании при комнатной температуре раствор цетилпиридинийхлорида (1/50-1/120 от исходного оЪъема суспенэии вируса) так, чтобы конечное весовое соотношение катион- ный детергент — белок быпо 1: 11,5:1. После перемешивания в течение 1 ч при комнатной температуре

3 3 смесь центрифугируют при 6000 ° g в течение 10 мин прн комнатной температуре или пропускают под избыточным давлением 1,0-0,3 атм через мембрану с диаметром пор 52+2 нм или 420+20 нм, супернатант нли фильтрат охлаждают при 1-4 С в те" чение 16 ч и раствор гликопротеинов отделяют от осадка детергента при

1-4 С центрифугированием при

15000 g в течение 15 мин, или декантацией, или микрофильтрацией через фильтр с диаметром пор

420 + 20 нм. Работу проводят в асептических условиях, а в случае необходимости стерилизацию раствора гликопротеинов осуществляют пропусканием через каскад фильтров с диаметром пор 0,8-1,4 мкм и 0,22 мкм.

Определение остаточного количества детергента в растворе гликопротеинов проводят быстро и с высокой чувствительностью по разности оптических плотностей при 260 и 280 нм в отличие от обычно применяемых менее чувствительных цветных реакций.

В табл. 2 приведены данные выделения гликопротеинов сочетанием ультрафильтрации и декантации или «нкрофильтрации и декантации.

Пример 1. Получение гликопротеинов вируса гриппа сочетанием ультра- и микрофильтрации.

В 40 мл взвеси концентрированного и очищенного вируса гриппа штамм

А, /Ленинград/385/80 (H3N2) в 0,01 М натрий-фосфатном буфере с О, 15 М хлористого натрия рН 7,2 титр вируса в РГА 1:16384, весовое содержание гемагглютинина в реакции одиночной радиальной иммунодиффуэии (ОРИД)

200 мкг/мл, общее содержание белка

430 мкг/мл, добавляют при перемешивании 0,34 мп 5Х-ного водного раствора цетилпиридинийхлорида (соотношение катионный детергент:белок равно 1:1) и перемешивают в течение ч при комнатной температуре. Смесь пропускают при 22 С со скоростью

0,7 мп/мин под давлением 0,4 атм через полнядерную мембрану .(эффективная поверхность 12,5 см ) с диаметром пор 52+2 нм, мембрану промывают 10 мл 0,01 М фосфатно-солевого буфера рН 7,2. Ультрафильтрат (50 мп, 300 мкг/мл белка, 130 мкг/мл гемагглютинина, титр РГА

1:2048) охлаждают прн 3 С в тече3 111 ние 16 ч, выпавший осадок детергента отделяют микрофильтрацией при

3 С со скоростью 200 мл/ч под избыточнык давлением 0,3 атм через полиядерный фильтр (эффективная поверхность 3,6 см2) с диаметром пор 420+20 нм.

Полученный раствор гликопротеинов (49 мл) содержит в 1 мп 246 мкг белка (70X от содержания в очищенном концентрате вируса), t17 мкг/мл гемагглютинина (71 ), 30 мкг цетилпирндинийхлорида, имеет титр РГА

1:8192 и имеет SOX нейраминидазной активности. Наличие и чистота гемагглютинина и нейраминидаэы в растворе гликопротеинов подтверждены данньвчи электронной микроскопии и электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия — никаких примесных компонентов этими методами выявить не удалось. При разведении до 15 мкг гемагглютинина в дозе (0,5 мл) пре= парат оказался безвредным и апирогенньи для животных: при проверке иимуногенности на крысах среднегеометрический титр сыворотки в реакции подавления гемагглютинина составил 508+23 после двухкратного введения с интервалом 28 3 дня.

Аналогичным образом получен раствор гликопротеинов вируса гриппа из штамма А,/Киев/59/79.

В табл. приведены выходы гликопротеинов вируса гриппа А /Ккев/59/

/79.при их выделении сочетанием ультра и микрофильтраций.

Пример 2. Получение гликопротеинов вируса гриппа ультрафильтрацией с последующей декантацией.

Этот пример отличается от примера

1 тем, что отделение.гликопротеинов проводят на мембране PSVP.(Ишлипор, США) вместо полиядерной мембраны

50 нм (г.Дубна), а отделение осадка детергента, выпавшего при охлаждении (+1 С, 16 ч) осуществляют декантацией. В полученном растворе гликопротеинов (50 мл, табл.2) по данным электрофореза в полиакриламиднои геле в присутствии додецилсульфата натрия обнаружены только гемагглютинкн н нейраминидаза..

8573 4

55

Пример 3. Получение гликопротеинов вируса гриппа микрофильтрацией с последующей декантацией.

Этот пример отличается от приме5

45 ра 1 тем, что после обработки очищенного концентрата вируса гриппа

А„/Киев/59/79 HtNt 5 -ным водным раствором цетилниридинийхлорида (0,23 мл, соотношение детергент:белок равно 1,5:1) при 18 С,смесь пропускают со скоростью 200 мл/ч под избыточныи давлением 0,3 атм через полиядерный фильтр (эффективная поверхность 3,6 см ) с диаметром пор 420+20 ни, фильтрат дополнительно промывают !О мп

0,01 М фосфатно-соленого буфера с рН 7,2 ° Дальнейшую обработку фильтрата после охлаждения (2 С, 16 ч} проводят, как описано в примере 2 (табл.2). Степень чистоты полученного раствора гликопротеинов по данным злектрофореза в полиакрилаиидном геле аналогична описанным в примерах к 2 °

Пример. 4. Получение гликопротеинов вируса гриппа А, /Ленинград/ /385/80 низкоскоростным центрнфугированиеи.

К 41 мп очищенного концентрата вируса гриппа А, /Ленинград/385/80 (H3N2), содержащего в 1 ил

1270 мкг белка, 599 мкг геиагглютинина, с титром РГА 1: 10240, добавляют 1,04 ил 5Х-ного водного раствора цетилпиридинийхлорида (соотношение детергент:белок равно 1:1), перемешивают в течение ч при 20 С и центрнфугируют при 6000 - g в течение 10 мин. Суцернатант (41 мл, белок — 1020 мкг/мл, 80 Х;гемагглютинин — 470 мкг/мп, 78Х. РГА—

1:8192, нейраминндазная активность — 75X от исходного) охлаждают при 4 С в течение 16 ч и центрифугируют при 4 С в течение 15 мкн при

15000 -.g. Сунернатант (41 wt, белок—

890 мкг/мл, 70Х; гемагглютинин—

424 икг/мл, 71Х; РГА — 1:10240 ° нейраминндазная активность — 72X, цеткппиридкнкйхлорид — 0,004X) стерилизуют пропусканием через мембрану

GSMP (0,22 мкм, Ииллипор, СИ!А) к в фильтрат добавляют 13 мл стерйльного

0,01 М .фосфатно-солевого буфера с рН 7,2 для снижения концентрации гликокротеинов. Стерильный раствор гликопротекнов (54 мп) содержит в 1 мп 520 икг белка, 54Х; 300 мкг геиагглюткнина, 66Х; 30 мкг цетилпиридинийхлорида; имеет титр РГА

1:St92 и 63Х нейраююнидазной актив1118573 ности от активности исходного виру5

30

45

50 са. Степень чистоты полученного препарата аналогична описанной в примере 1, при хранении в растворе при 4 С в течение 1 года активность гемагглютинина и нейраминидазы снижается на 20Х.

При разведении до 15 мкг гемагглютинина в дозе препарат оказался апирогенным.

Пример 5. Получение гликопротеинов вируса гриппа А/Техас/77 низкоскоростным центрифугированием.

К 10 мл очищенного концентрата вируса гриппа А/Техас/77 (H3N2),содержащего в 1 мл 980 мкг белка, 390 мкг гемагглютинина с титром РГА

1:81920, добавляют 0,2 мп 5Х-ного водного раствора цетилпиридинийхлорида (соотношение детергент:белок равно 1:1), перемешивают в течение" 1 ч при 20 С и центрифугируют при 6000 g в течение 10 мин.

Супернатант (10 мл, белок 620 мкг/мл, 63%; гемагглютинин — 270 мкг/мл, 69%;.титр РГА — 1:24576, нейраминидазная активность 65% от исходного) охлаждают при 3 С в течение 16 ч и центрифугируют при 3 С при 15000 g в течение 15 пан. Супернатант (10 мл, белок 570 мкг/мл, 58%; гемагглютинин 250 мкг/мл, 65%., титр РГА

1:81920; нейраминидазная активность

6 1%, цетилпиридинийхлорид 0,003%) стерилизуют пропусканием через мембрану GSWP (0,22 мкм, Миллипор, США) и получают стерильный раствор гликопротеинов (10 мл, белок

440 мкг/мл, 45%; гемагглютинин

220 мкг/мл 57Х; титр РГА 1:65536, нейраминидазная активность 54% от активности исходного вируса). Степень чистоты полученного препарата аналогична описанной в примере 1.

Пример 6 (прототип). К

10 мл очищенного концентрата вируса гриппа А /Ленинград/385/80 (H3N2), содержащего в 1 мл 700 мкг белка, 310 мкг гемагглютинина, с титром РГА 1:16384 добавляют

0,7 мл 0,5%-ного водного раствора цетилпиридинийбромида (соотношение детергент:белок равно 1:2), о выдерживают в течение 1 ч при 20 С и смесь ультрацентрифугируют (ультрацентрифуга Бекман L 65, 3 ротор 60 Ti) при 105000 - g в течение 1,5 ч. Супернатант, фракция солюбилнзированньж нммуногенных гликопротеинов, (10 мл) содерямт в 1 мл : белка — 230 мкг, 33%;гемагглютинина 93 мкг, 30%, имеет титр 1:2048 и 26% нейраминидазной активности.

Подобные результаты получены при использовании цетилпиридиний- хлорида вместо цетилпиридинийбромида в аналогичных условиях.

Пример 7 (прототип). Этот пример отличается от примера 6 тем, что соотношение цетнлпиридинийбромида к белку равно 1:5. Полученный раствор гликопротеинов содержит в

1 мл: белка — 70 мкг, 10%,гемагглютинина 25 мкг, 8%1 титр РГА 1:512 и

8% нейраминидазной активности.

Таким образом, из сравнительных примеров, следует, что как в случае цетилпиридинийбромида, так и цетилпиридинийхлорида при максимальном соотношении детергент:белок„ равном 1:2, как указано в известном способе, выход солюбилизированных гликопротеинов составляет 26-33Х.

Основными преимуществами предполагаемого способа получения иммуногенных гликопротеинов вируса гриппа с катионным детергентом — цетилпиридинийхпоридом являются: использование при выделении иммуногенных гликопротеинов ультрафильтрации или низкоскоростного центрнфугирования, что позволяет упростить способ, который не требует дорогостоящего оборудования (ультрацентрифуги) и высококвалифицированного технического обслуживания использование соотношения цетилпиридинийхлорид:белок

1,0:1-1,5: 1 позволяет повысить выходы гемагглютинина и нейраминидазы с

26-30X,до 59-80X," простота удаления выпавшего осадка цетилпиридинийхлорида декантацией или микрофильтрацией, наряду с небольшими потерями (5-10X) гликопротеинов, в отличие от обычно применяемого для удаления детергента продолжительного и связанного с потерями диализа, использование кассет тангенциального потока (для ультра- и микрофильтрации) и дешевых отечественных полиядерных мембран упрощает технологический процесс получения гликопротеинов.

1118573

Т а блица.Микро@ильтрат Ультрафильтрат +

Исходный концентрат вируса

Единица измерения

Показатели

20

1О

Объем мл

256 мкг/мл

230

760

Белок

100

67 мкг/мл

240

Гемагглютинин

59

100 условная единица активности « ) 165

620

171

100

Нейрамннидаза

РГА титр в пробе

1024

5120

16768 1,Препарат, полученный после обработки (1 ч, 22 С) концентрата вируса гриппа цетилпиридинийхлоридом -57;ным водным раствором (0,15 мл), .и последующего пропускания смеси через мембрану с диаметром пор 52+2 нм.

"« Препарат, полученный после охлаждения (З С, 16 ч) ультрафильтрата и отделения осадка детергента на полиядерном фильтре с диаметром пор 420i20 нм.

++ 1 количество (мкг) N-ацетилнейраминовой. кислоты, отщепившейся от овомуцина в расчете на 1 мл раствора гликопротеинов.

Таблица 2

Пример 3

А, /Киев/59/79

Ультрафильткон- рация центрат

Пример 2

Показате- Единица ли измерения

А, /Ленинград/385/80

Декантация

Исходный

Декантация

Ультрафильтрация

Исходный концентрат вируса

20

50 10

256 760

74 100

104 240

50

Объем

243

2?5 мкг/мл 430

300

72

t00

Белок

Гемагглютинин

80 мкг/мл 200

120

1118573

Продолжение табл, 2

Пример 2

Показа

Пример 3

Единиц змере

А /Ленинград/385/80

А1/Киев/59/79

Декант ция

Исходный

Декантация

Гемагглютинин

67

100

100

1050 780

700 620

186

158 ти

Нейраминидаза

100

100

8192 16384 1024 6044

РГА титр в пробе

16384 2048

Составитель П. Вонарцев

Текред Л,Коцюбняк . Корректор И. Куска

Редактор Т. Парфенова

Заказ 7351/14

Тираж 507 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35,.Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,4 условная единица активносИсходный концент рат ви руса ьтрафильтрая концентрат

Ультрафильтрация