Способ получения иммобилизованных оксидоредуктаз

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ОКСИДОРЕДУКТАЗ путем добавления буферного раствора ферментов к пористому неорганическоиу носителю - окиси алюминия, отличающийся тем, что, с целью увеличения стабильности целевого продукта и ускорения способа, буферный раствор ферментов предварительно смешивают с золем кремниевой кислоты, имеющим рН 7-8 и застывающим в порах носителя за 1-2 мин, а затем пропитывают полученной смесью сухую окись алюминия ипи сухой силикагель.

CQO3 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) y(g1) С 12 N 1/14

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ н вто сноьаг свидкткльствм

l .

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3512069/28-13 (22) 17.11.82 (46) 23.12.84. Бюл. Р 47 (72) В.Д. Соколовский и Г.А.Коваленко (71) Ордена Трудового Красного Знамени институт катализа Сибирского отделения AH СССР (53) 577.15(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

Р 530885, кл. С 12 N 11/14, 1977, . 2. Messing R.A., Bj.otechnol.

- Bioenp, 1974, 16, 897.. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИИИОБИЛИЗОВАННЫХ ОКСИДОРЕДУКТАЗ путем добавления буферного раствора ферментов к пористому неорганическоиу носителю — окиси алюминия, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью увеличения стабильности целевого продукта и ускорения способа, буферный раствор ферментов предварительно смешивают с золем кремниевой кислоты, имеющим рН 7-8 и застывающим в порах носителя за 1-2 мин, -а затем пропитывают полученной смесью сухую окись .алюминия кпи сухой силикагель.

598 2

Сущность способа заключается в том, что свежеприготовленным золем кремниевой киЧлоты с растворенным в нем ферментом (рН 7-8) пропитывают сухой носитель, в порах которого за 1-2 мин происходит желатиниэация золя, и образуется гидрогель с включенным в него ферментом. Таким образом, фермент оказывается заключенным одновременно и в гель, и в пористую структуру неорганического носителя.. Вся процедура иммобилизации занимает 5-10 мин и отличается простотой и технологичностью.

Полученные предлагаемым способом препараты сочетают в себе преимущества иммобилизации в геле (высокая стабильность и активность) с преимуществами иммобилизации на неорганических носителях (устойчивость в водных средах, высокая механическая прочность, хорошие гидродинамические показатели и являются перспективными для практического применения в высокопроизводительных реакторах колоночного типа. Кроме того, предложенный способ в силу мягкости условий иммобилизации. комнатная температура, нейтральные значения рН, отсутствие инициирующих радикальные реакции добавок, является более предпочтительным для иммобилизации таких лабильных, сложных по строению, как правило, субъединичных ферментов, как оксидоредуктазы. Конкретно способ осуществляется следующим образом.

1 1130

Изобретение относится к .способам иммобилизации ферментов класса оксидоредуктаз на неорганических носителях и получению на их основе эффективных гетерогенных биокатализаторов для практического применения.

Известен способ "двойной иммобилизации" ферментов в полиакриламидном геле, армированном неорганичес- 10 ким скелетом: кремнезернистым или металлическим материалом с диаметром пор свыше 700 А (1), Недостатком способа является возможность значительной дезакти- 15 вации ферментов в процессе свободнорадикальной полимериэации геля, кроме того получаемый способом конечный продукт имеет низкие физико-механические характеристики! малую20 механическую прочность, большое гидродинамическое сопротивление.

Наиболее близким к предлагаемому способу по технической сущности и достигаемому положительному зффек- 25 ту является способ получения иммобилиэованных оксидоредуктаз путем добавления буАерного раствора Аерментов к пористому неорганическому носителю — окиси алюминия (5,, =

100 м /г, .радиус пор = 175 А, О, 6 см /r), причем и качестве фермента используют глюкозооксидазу (2, Недостатками способа являются длительность процесса получения иммобилизованного фермента (адсорбция протекает в течение 17-18 ч) и .низкая стабильность полученного препарата (адсорбированный фермент 4О дезактивируется эа 7 сут). Целью изобретения является увеличение стабильности целевого продукта и ускорение процесса иммобилизации.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения иммобилизованных оксидоредуктаз путем добавления буферного раствора фермен.5О тов к пористому неорганическому носителю окиси алюминия, буферный раствор ферментов предварительно смешивают с золем кремниевой кислоты, имеющим рН 7-8 и застывающим в порах 55 носителя за 1-2 мин, а затем пропи" тывают полученной смесью сухую

I окись алюминия или сухой силикагель.

Навеску сухого носителя пропитывают по влагоемкости свежеприготовленным золем кремниевой кислоты с растворенным в нем ферментом. Золь" кремниевой кислоты образуется при смешении в тщательно подобранных пропорциях растворов метасиликата натрия (228 г/л), соляной кислоты (6X).è буферного раствора фермента с таким расчетом, чтобы значение рН этой гелеобразующей смеси было нейтральным (во избежании дезактивации фермента под действием рН), и ее отверждение происходило после пропитки в порах неорганического носителя, т.е. через 2-3 мин после приготовления. Соотношение объемов жидкого стекла, соляной кислоты и раствора Аермента — 1:5: 1. После застывания смеси в порах измеряют

3 11305 ферментативную активность и стабильность полученного препарата иммобилиэованного фермента.

Активность иммобилизованных ферментов измеряется в циркуляционной установке с дифференциальным безградиентным реактором термостатио руемым при 25 С. Стабильность определяется при хранении в .буфере и комнатной температуре. Потеря 98Х 1О активности считается полной дезактивацией фермента.

Пример 1. Иммобилиэация глюкозооксидазы в порах окиси.алю миния. 15

Навеску (25 мг) сухой 8 -окиси алюминия,(5,„= 84 м /г, г =120 А, Г2 = 800 А, М = О, 4 см /г) пропитывают 20 мкл свежеприготовленного золя кремниевой кислоты с растворенной в нем глюкозооксидазой (ГО), который застывает через 1 мин в порах носителя, рН смеси — 7,0.

Ферментативную активность полу.ченного препарата измеряют полярографически по убыли кислорода в реакционном растворе. Стабильность определяют при хранении в буфере (рН 6,0) и комнатной температуре (20-22 С).

Иммобилизованная предлагаемым спо-ЗО

er ГО

-собом ГО 2,9 (сохраняет мл ела(32Х активности нативного фермента.

При иммобилизации стабильность глюкоэооксидазы увеличивается: иммо- З билизованный фермент сохраняет 100Х первоначальной активности по исте чение 1,5 месяцев хранения, тогда как нативная ГО полностью деэактивируется эа 30 сут. 49

Пример 2. Иммобилизации глюкозооксидазы в порах окиси алюминия.

Иммобилиэацию ГО проводят способом описанным в примере 1, только под. бирают условия таким образом, чтобы золь застывал в порах носителя через 2 мин после пропитки (рН смеси — 8,0). Свойства полученного препарата иммобилизованной глюкозооксидазы аналогичны примеру 1 °

Пример 3. Иммобилиэация дрожжевой алкогольдегидрогеназы в порах окиси алюминия.

Иммобилизацию алкогольдегидрогеназы (АДГ) в порах & -окиси алюми-. ния проводят по методике примера Т, Активность АДГ измеряют спектро- фотометрически по скорости появ-.

98 4 ления в ферментативной реакции окисления зтанола в ацетальдегид кофермента NAQ H, который поглощают при 340 нм. Стабильность определяют в буфере (рН 8,0) и при комнатной температуре (20-22 С).

О

При иммобилизации АДГ сохраняется от 6 до 100Х активности нативного фермента в зависимости от ее концентрации в геле кремниевой кислоты.

Стабильность иммобилиэованной АДГ увеличивается в сравнении с нативным ферментом в 1,5-4 раза алкогольдегидрогенаэа в растворе полностью дезактивируется за 10 сут, иммобилизованный фермент — за 2-3 недели.

Пример 4. Иммобилиэация дрожжевой алкогольдегидрогеназы в порах силикагеля.

Иммобилизацию АДГ в порах силио кагеля (8 < = 110 м /г, r„ = 240 А, J

Ч = 0,6 см /г) проводят в условиях, описанных в примере

При иммобилизации алкогольдегидрогеназа сохраняет от 3 до 82Х активности нативного фермента в зависимости от ее концентрации в геле кремниевой кислоты.

Эффект стабилизации алькогольдегидрогеназы, иимобилиэованной в порах силикагеля, зависит от рН буферного раствора, используемого для хранения полученного препарата . При нейтральных значениях рН (6,0, 7,0) стабильность включенной АЦГ увеличивается в 1 5-3 раза по сравнению с нативным ферментом: иммобилизованная АДГ полностью теряет активность по истечение 1,5 месяца хранения, тогда как .нативная — эа 1520 сут. При щелочных значениях рН (8,0) стабилизация АДГ незначительна в силу увеличения растворимости силикагеля при рН > 7,0 (100 мг/л).

Следовательно, для ферментов, рН-оптимум которых находится в щелочной области (алькогольдегидрогенеза), рекомендуется, испольэовать в качестве носителя только окись алюминия, для ферментов с .кислым значением оптимального рН (глюкозооксидаза) — силикагель и окись алюминия.

Наиболее существенным является то, что рН гелеобразующей смеси долж но быть близким к нейтральному значению (7-8) во избежание инактива1ции фермента под действием щелочных

1130598

Составитель В. Муронец

Редактор А. Шандор Техред О.Ващишина Корректор О. Билак

Заказ 9520/22 Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб, д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 (раствор жидкого стекла, рН 14) или кислых (соляная кислота, рН 1) значений рН. При дальнейшей работе с препаратом иммобилизованного фермента (хранение определения активности) рН в геле определяется значением рН рабочего буфера.

Время застудневания золя подбирается таким образом, чтобы золь кремниевой кислоты успел пропитать пористый носитель и его желатинизация проходила именно в порах.

Главным достоинством предлагаемого способа является ускорение .всего процесса получения иммобилизованного фермента: процедура иммобилизации занимает 5-10 мин и складывается из взвешивания носителя (2-7 мин), смешения реагентов (0,5-1 мин), пропитки (0,1-0,2 мин) и застудневания (1-2 мин), Таким обраэом, использование

5 предлагаемого изобретения позволяет значительно увеличить стабильность целевого продуктами ферменты сохраняют активность в течении

1-1,5 месяцев (по известному способу дезактивация происходит через 1 неделю). Время иммобилизации также снижается с 17-18 ч до 5-10 мин.

Способ позволяет получать высокоактивные и стабильные препараты иммобилизованных ферментов с хорошими техническим характеристиками: высокой механической прочностью и малым гидродинамическим сопротивлением.