Способ получения @ -маннаназы

 

Союз Советсмма

Соцмалмстмчесина

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свмд-ву (22) Заявлено 06.02.81 (21) 3247449/28 — 13 с присоединением заявки J4 (5! )М. Кл.

С 12 и 1/14

С 12 N 15/00

Ркудврстванай квинтет

СССР ав двлам «эобрвтеввв н открытий (28) Приоритет

Опубликовано 15 09.82. Бюллетень № 34

Дата опубликования опмсаммя 15.09.82 (S8) 3 Д К 577. 152 (088.8) И. Н. Павлова, И. Я. Захарова и Н. 3. Тиньянова (72) Авторы изобретения

Р

Ордена Трудового Красного Знамени институт микробйологии==,:,. и вирусологии им. Д. К. Заболотного (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ а — MAHHAHA3bI

0,05

0,5

1

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к производству ферментных препаратов, и касается фермента аманнаназы, которая может быть использована в научно-исследовательских биохимических и

5 химических лабораториях в качестве аналитического препарата при установлении структуры маннанов, а также для .гидролиза маннанов и маннозосодержащих биополимеров при различных технол4гических процессах, когда их присутствие нежелательно, в частности при получении биологически активных веществ их дрожжей, при гидролизе высокополимерных углеводсодер-. жащих веществ в винах и пр.

f5

Известен способ получения фермента, ра щепляющего дрожжевой маннан, с помощыв культуры Arthrobacter 6-lÌ,,õðàíÿùåéñÿв коллекции живых культур лаборатории биохи- . мии Калифорнийского университета (Беркли, 20

ClIlA), питательной среде, содержащей источник углерода, азота, минеральные соли и воду, в ус- ловиях аэрации. Продуцент синтезирует внеклеточную маннанаэу на среде состава, в г/л:

Дрожжевой маннан 1,0

Аммоний сернокислый 0,5

Магний сернокислый 0,2

Железо сернокислое закисное 0,01

Кальций хлористый двухводный

Дрожжевой экстракт

Калий фосфорнокислый двузамеше нный 7,54

Калий фосфорнокислый однозамеще нный 2,32

Вода До 1 л и 111

Ферментация проводится прн 30 С на качалке в течение 36 ч, Маннаназная активность культуральной жидкости составляет 5 — 6 ед/мл.

Недостатком этого способа является применение в качестве продуцента и — маннаназы недоступного для использования в нашей стране штамма микроорганизма иэ рода Arthrobacter.

Пель изобретения — повышение активности целевого продукта и его удешевление.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения а — маннаназы путем культивирования микроорганизма продуцента

3 958498 на питательной среде, содержащей источник углерода, азота, минеральные соли и воду, в условиях аэрации, в качестве продуцента используют штамм Nocardia erythropo1is ИМ — 19, а в качестве источника углерода — клетки пекарских дрожжей в количестве 10 — 20 г/л.

Штамм ИМ — 19 выделен иэ лесной почвы в районе r. Киева. Хранится в центральном музее промышленных микроорганизмов, "ВНИИГенетика" под номером ЦМПМ S — 555. Штамм имеет1О следующую характеристику, !

Морфологические признаки. Культура N.erythropo1is ИМ — 19 не образует воздушного мицелня. При росте на органических средах клетки 14 — 16 — часовой культуры представляют 15 собой длинные тонкие прямые или слегка искривленные палочки, иногда разветвленные. К

24 часам роста клетки становятся палочками средних размеров (6 — 8 мк х 0,6 — 1,0) „появляются кокки. К 36 часам роста наблюдается 20 преобладание кокковидных клеток. Клетки ве имеют капсул и эндоспор, неподвижные, грамположительные, слабо кислотоустойчивые.

На агаризованных органических средах рост культуры N.erythropo1is ИМ — 19 обильный,. 2$ колонии гладкие, блестящие, пастообравные, бледнорозовые. При росте в МПБ культура образует муть и обильный осадок.

Культуральные и биохимические свойства, Штамм N.erythropo1is ИМ — 19 растет при

10 — 40 С (оптимальная температура 28" С при значениях рН среды 6,0 — 10,0 в аэробнь1х условиях. Предлагаемый в качестве продуцента а — маннаназы микроорганизм способен расти на средах с S o NaC1, но не растет при 7% этой соли в среде.

В гидролиэатах клеток этого штамма обнаружены в больших количествах арабиноза, галактоэа и глюкоза, а также мезодиаминопимелиновая кислота и характерный для нокардий липид

LCN — А.

Культура N.erythropo1is ИМ — 19 сбраживает с образованием кислоты глюкозу, сахарозу, ксилозу, маннозу, рамнозу, фруктоэу, глицерин, маннит, сорбит и не сбраживает арабиноэу, 45 галактозу, лактозу, мальтозу, раффиноэу, сорбоэу, салицин, дульцит и метил-0-глюкозид.

Штамм N.erythropo11s ИМ — 19 способен испольэовать в качестве единственного источника углерода натриевые соли лимонной, молочной, пировиноградной, уксусной, янтарной и бензойной кислот, а также дрожжевые а -маннаны.

Найтрий виннокислый и щавелевокислый культурой не утилизируются. Микроорганизм растет на средах с аммонийными солями в качестве источника азота.

5S

Штамм не пептонизирует молоко, не разжижает желатину, не гидролизует крахмал, нитраты восстанавливает до нитритов слабо, образует

0,03 — 0 05

Замена в среде дорогостоящего и трудно нарабатываемого в лабораторных условиях маннана клетками пекарских дрожжей и устранение из нее дрожжевого экстракта делает среду экономически более выгодной и более доступной для изготовлений.

Предлагаемый. способ получения а-маннаназы. состоит из двух стадий.

Стадия 1. Выращивание инокулюма.

Питательную среду засевают маточной куль- турой N.erythropot is ИМ — 19, выращенной на плотной среде состава, г/л воды:

Клетки пекарских дрожжей . . 3,0

Аммоний сернокислый 0,5

Магний сернокислый 0,2

Кальций хлористый 005

Железо сернокислое . эакисное

Калий фосфорнокислый двуэамеще нный 7,54

Калий фосфорнокислый однозамещенный 2,32 дрожжевой экстракт 0,5

Агар — агар 15 — 20

Выращивание инокулюма проводят в жидкой среде, состава, г/л воды:

Клетки цекарских дрожжей

Аммоний сернокислый

Магний сернокислый

Кальций хлористый двухводный 0,05

Калий фосфорнокислый двузамеще нный 7,54

0,01

0,5

0,2 ф тирозиназу, каталазу, р-нитрофенолоксидаэу. На известной полусинтетической среде при глубинном выращивании синтезирует внеклеточную а -майнаназу . Активность к 36 часам выращивания составляет 10 — 17 ед/мл кулътуральной жидкости.

Сущность способа состоит в том, что ппамм

N.erythropo1is ИМ — 19 выращивают на среде, отличающейся от описанной выше и использовавшейся для выращивания продуцента а-маннаназы из рода Arthrobacter, а именно на среде, содержащей вместо дрожжевого маннана в качестве источника углерода клетки пекарских дрожжей и имеющей состав, г/л:

Клетки пекарских дрожжей 10-20

Аммоний сернокислый 0,2 — 0,5

Магний сернокислый . 0,2

Кальций хлористый двухводный

Калий фосфорнокислый двузамещенный 7,54

Калий фосфорнокнслый одноэамещеннйй, 2,32

Вода водопроводная До 1 л рн 70 — 7P

958498

005

10,0

0,2

0,2

7,54

Калий фосфорнокислый одно замещенный гзг рН 7,0 — 7,2

Выращивание проводят в 0,5 — литровых колбах со 100 мл среды на качалке с 220—

240 об/мин в течение 24 — 30 ч при 27 — 29С.

Стадия 2. Биосинтез а-маннаназы.

В 0,5 — литровые колбы, содержащие 100—

125 мл аналогичной среды с дрожжевыми клетками (состав ее приведен выше), вносят 5% fQ к объему среды инокулюма, Ферментацию ведут на качалке с 220 — 240 об/мин при 27 — 29 С в течение 36 — 40 ч. Активность культуральиой жидкости к этому времени составляет 10—

17 ед/мл, в течение 5 — 7 ч оиа остается ста- !5

, бильной, затем начинает медленно снижаться.

Активность а-маннаназы определяют по нарастанию количества редуцирующего сахара (маннозы) в инкубационной смеси, содержащей исследуемый материал (культуральную жидкость), субстрат (маннаи пекарских (дрожжей) и соответствующий буфер. За единицу активности принимают такое количество фермента, которое обуславливает образование

1 мкмоля маннозы при гидролизе маннана в условиях опыта за 1 ч.

Количество редуцирующего сахара (маннозу) определяют по методу Нельсона — Сомоги.

Фермент из культуральной жидкости вьщеляют известным способом. Полученный с помощью N.erythropol is ИМ — !9 препарат а-маннаназы катализирует гидролиэ а-манапов по связям 1,2 и 1,3 с опцеплекием маннозы. . Использование предлагаемого способа может быть проиллюстрировано следующими . примерами.

Пример 1. Выращивание инокулюма штамма N.erythropol is ИМ — 19 и ферментацию проводят на среде, предложенной для синтеза маннаназы микроорганизмом иэ рода

Arthrobacter в 0,5-литровых колбах, содержащих по 100 мл среды, на качалке с 240 об/мин.

Колбы для выращивания инокулюма засевают

2- суточной культурой Й.erythropo f is ИМ — 19 выращенной на агариэованной среде того же состава, и инкубируют их 24 ч при 28 С.Затем посевной материал (инокулюм) в количестве 5% к объему среды вносят в ферментационные колбы и ведут инкубацито 36 ч при той же

50 температуре. К концу ферментации активность . культуральной жидкости составляет 2,6 ед/мл. Вы. деление а-маннаназы из культуральной жидкости осуществляют известным способом. П р и. м е р 2, Вырицивание инокулюма проводят на той же среде и в тех же услови55 ях, что и в примере 1.

Ферментацию проводят на среде состава, г/л воды:

Сухие клетки пекарских дрожжей 10,0

Аммоний сер нокислый 0,5

Магний сернокислый 0,2

Кальций хлористый двухводный

Калий фосфорнокислый двуэамещенный 7,54

Калий фосфорнокислый одно замешенный 2,32 рН 7,0

Выращивание культуры проводят в усло-виях примера 1..Активность культуральной жидкости к концу ферментации составляет

13,7 ед/мл, т. е. в 5 раз выше, чем при выращивании продуцента на среде с маннаном (пример 1).

Пример 3. Выращивание инокулюма и ферментацию проводят в условиях, приведенных в примере 1, на среде, содержащей клетки пекарских дрожжей (состав среды приведен в примере 2). Активность культуральной жидкости к концу ферментации составляет !7 ед/мл.

Пример 4. Выращивание инокулюма и ферментацию проводят в условиях примера1 на среде состава, г/л воды:

Клетки пекарских дрожжей

Аммоний сернокислый

Магний сернокислый

Кальций хлористый двухводный 0,03

Калий фосфорнокислый дву замещенный

Калий фосфорнокислый однозамещенный 2,32

Активность культуральной жидкости к концу ферментации (40 ч) составляет 10,6 ед/мл.

Пример 5. Выращивание инокулюма проводят на среде, приведенной в примере 2, в условиях примера 1.

Ферментацию проводят в условиях примера

1 на среде состава, г/л воды:

Клетки пекарских дрожжей 20,0

Аммоний сернокислый 0,2

Магний сернокислый 0,2

Кальций хлористый 0,03

Калий фосфорнокислый двузамещенньй 7,54

Калий фосфорнокнслый одноэамещенный 2,32

Активность культуральной . жидкости N.erythropol is ИМ — 19 к концу ферментации составляет 172 ед/мл.

Сравнительная характеристика а -маннаназной активности штамма N.erythropol is ИМ — 19 на различных средах приведена в таблице.

Таким образом, предлагаемый штамм

N.erythropol is ИМ — 19 при выращивании на рекомендованной среде с дрожжевыми клетками

7 958498 8 проявляет более высокую (в 2 — 3 раза) а-ман- по сравнению z известным в литературе пронаназную активность при удешевления среды, центом этого фермента Arthrobacter G-IM — 1.

Среда для ферментации

Пример

Среда . для выращива1 ния инокулюма — +-Ф

Активность, ед/мл с маннаном с маннаном с маниаком с дрожжевыми клетками, 10 г/л

13,7 с дрожжевыми клетками, 10 r/ë с дрожжевыми клетками, 10 г/л

170

106 с дрожжевыми клеткамя, 20 г/л

17,2

Формула иэобрете ния

Состиюитель И. Привалова

Техред Т. Фанта

Корректор Г. Orap

Редактор М. Келемеш

Заказ 6983/37 .

Подписное

Тираж 505

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Способ получения а-маннанаэы путем культивирования микроорганизма продуцента на питательной среде, содержащей источник углерода, 25 азота, минеральные соли и воду, в услвиях аэрации, о т л и ч а ю щ я Й с я тем, что, с целью повышения активности целевого про,- дукта и его удешевления, в качестве продуцента используют штамм Nocardia erythropo1is ИМ — 19, а в качестве источника углерода— клетки пека1эскях дрожжей в количестве 10—

20 г/л.

Источника информации, принятые so внимание при экспертизе

1. Jones G. Н., Ba11on С. Е. Iso1ation of

an а-mannosidase which hidro1ised yeast man—

nan. Structure of the backbone of yeast merman.— J. Sio1. Chem. 1968, 243, 9, р. 2442—

2446.