Способ определения активности полифенолоксидазы

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОС-. ТИ ПОЛИФЕНОЛОКСИЛАЗЫ, включающий обра;бртку пробв субстратом, о т л и ч аю Щ ни с я тем,-что, с целью одновременного определения в той же пробе активности пероксидазы, в исследуемую пробу вносят о -дифенол в количестве 10 -10 моль/л, поддерживают в пробе рН равным 5,5-6,0, измеряют изменение во времени окислительно-восстановительного потенциала пробы, увеличивают рН пробы до 7,5-8,0, вносят перекись водорода.в количестве 0,3-3 об.%, вновь измеряют изменение во времени окислительно-восстановительного потенциала , а активность полифенолоксидазы и пероксидазы определяют по величинам первых производных зависимостей окислительно-восстановительных потенциалов от времени, полученных соответственно в первом и втором , опытах.i

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

ОИ Ю

РЕСПУБЛИН (l9) (11) 4(st)G 01 N 27/52

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬГЬЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3662776/28-13 (22) 14. 07. 83 (46) 15.06.85. Бюл. И - 22 (72) С,Н.Суслов (71) Научно-исследовательский институт биологии при Иркутском государственном университете им. А.А.Жданова (53) 577. 15.022 (088.8) (56) 1.Авторское свидетельство СССР

Ф 706771, кл. С 01 И 33/54, 1978. (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПОЛИФЕНОЛОКСИДАЗЫ,включающий обработку пробы субстратом, о т л и ч аю ц и и с я тем,.что, с целью одновременного определения в той же пробе активности пероксидазы, в ..исследуемую пробу вносят О -дифенол в количестве

10 -10 моль/л, поддерживают в пробе рН равным 5,5-6,0, измеряют изменение

so времени окислительно-восстановительного потенциала пробы, увеличивают рН пробы до 7,5-8,0, вносят перекись водорода в количестве 0,3-3 об.Ж, / вновь измеряют изменение во времени окислительно-восстановительного потенциала, а активность полифенолоксидазы и пероксидазы определяют по величинам первых производных зависимостей окислительно-восстановительных потенциалов от времени, полученных соответственно:в первом и втором

Ф опытах.

ЮФ

1161858

Составитель Е.Фетисов

Редактор M.Êåëåìåø Техред M.Íàäü Корректор Л.Бескид

Заказ 3964/46 Тираж 897 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", r.Óæãîðîä, ул.Проектная,4

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам определения активности оксидаэ.

Известен способ определения активности полифенолоксидазы, включающий 5 обработку анализируемой пробы раствором эскулетииа с последующимизмерением люминесценции полученного раствора 111Недостатком способа является невозможность определения активности 1О т пероксидазы и полифенолоксидазы одновременно.

Цель изобретения — одновременное определение активности полифенолоксидазы и пероксидазы в одной пробе.

Поставленная цель достигается, тем, что согласно способу, включающему обработку пробы субстратом, в исследуемую пробу дополнительно вносят

О -дифенол в количестве 10 - 10 "моль/л щ .поддерживают в пробе рН равным 5,5—

6,0, измеряют изменение во времени окислительно-восстановительного потенциала пробы, увеличивают рН до

7,5-8,0, вносят перекись водорода в р5 количестве 0,3-3,0 об,Х, вновь измеря ют изменение во времени окислительновосстановительного потенциала, а активность. полифенолоксидазы и пероксидазы определяют по величинам первых производных зависимостей окислитель-! но-восстановительных потенциалов от времени, полученных соответственно в первом и втором опытах.

Предложенный способ осуществляют следующим образом.

В электролитическую ячейку помещают платиновый и хлоросеребряный электроды, соединенные с потенциометром, а также исследуемую жидкость с рН =

= 5,5-6,0. Содержимое ячейки тщатель40 но перемешивают, вносят в нее 0,01 М раствор о -дифенола и при помощи самописца, соединенного с потенциометром, записывают кривую изменения по45 тенциала платинового электрода во времени. По достижении максимума на кривой в раствор вносят щелочь до достижения рН = 7,5-8,0, вносят перекись водорода в количестве 0,3 .—

3,0 о6,Х раствора в ячейке и вновь записывают кривую изменения потенциала электрода во времени. Запись прекращают по достижении второго максимума.

Кривые подвергают графическому дифференцированию и по полученным значениям первых проиэводных, используя заранее построенные калибровочные кривые, определяют концентрации ферментов.

Пример. 1 0 мл гомогената картофеля вносят в ячейку, содержащую 9 мп раствора с рН = 5,5-6,0, помещают в ячейку платиновый и хлоросеребряный электроды и включают мешалку (1000-1200 об/мин). После установления равновесного потенциала (1-2 мин) добавляют 1 мл 1 ° 1О М раствора о -дифенола с одновременным пуском самописца КСП-4, соединенного с прибором "рН-340". Происходит быстрое возрастание величины окислительно-восстановительного потенциала, отвечающее образованию о -бензохинона при окислении о -дифенола полифенолоксидазой, По выходе на максимум раствор подщелачивают 1-2 каплями 12 н. КОН до рН = 7,5-8,0 и добавляют 0,1 мп 307-ной Н 02 . Записывают кривую изменения потенциала за счет пероксидазного окисления о -дифенола. Запись прекращают после достижения второго максимума и начала спада потенциала.

Полученные кривые подвергают графической обработке, представляющей собой вычисление величин 4 †" 1

dt где E — потенциал электрода, мВ, — время, с .

По вычисленным значениям

У используя калибровочные кривые, построенные по растворам с известным содержанием фермента, определяют концентрации полифенолоксидазы и пероксидазы.

Использование предложенного способа позволяет сократить время анализа с 15-20 до 6-8 мин, т.е. в 2-2,5 раза.