Способ получения монослоя эритроцитов для проведения иммунологических реакций

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОСЛОЯ ЭРИТРОЦИТОВ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИММУНОЛО1ГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ путем обработки поверхности стекла или пластика раствором поликатионита с последующим нанесением эритроцитов и промыванием, о тличающийся тем, что, с целью упрощения способа, обработку . осуществляют 0,2-0,25%-ным раствором поли-N,N-димeтил-N,N-диаллиламмонийхлорида в течение 60-120 мин и для нанесения используют 4%-ную взвесь эритроцитов.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (I9) ((Il

SU (51)4 G 01 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3578085/28-14 (22) 13. 01. 83 (46) 30.09.85. Бюл. - 36 (72) В.Г. Брысин, M.М. Омеров, Д.Д. Зауров и Д.А. Топчиев (71) Андижанский государственный медицинский институт им. M.È. Калинина .(53) 612.05(088.8) (56) Иммунология, 1980, Н - 5, с. 80, (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОСЛОЯ

ЭРИТРОЦИТОВ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИММУНОЛО: ГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ путем обработки поверхности стекла или пластика раствором поликатионита с последующим нанесением эритроцитов и промыванием, о тличающийся тем, что, с целью упрощения способа, обработку . осуществляют 0,2-0,257-ным раствором поли-N,N-диметил-N,N-диаллиламмонийхлорида в течение 60-120 мин и для нанесения используют 4Х-ную взвесь эритроцитов.

1182

Составитель В.Дрозпов

Редактор А.Лежнина Техред А.Кикемезей Корректор М,Самборская

Заказ 6098/42

Тираж 896 !1одписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, )К-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Изобретение относится к иммунологии и может найти применение при экспериментальных и клинических ис.следованиях.

Целью изобретения является упрощение способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Чашки Петри (50 10 мм) тщатель. но обезжиривают в смеси Никифорова !О в течение 24-48 ч ° Перед постановкой опыта бинтом насухо протирают внутреннюю поверхность и наливают в каждую по 4 мл 0,2Х-ного раствора поли-.N,N-диметил-N,N-диаллиламмо- 15 нийхлорида (ПДМДААХ), инкубируют при комнатной температуре в течение 60 мин, после чего раствор поликатиона сливают, чашки трижды промывают забуференным физиологическим 2р ь раствором хлористого натрия с рН 7,2. Из трижды отмытых эритроцитов барабана готовят 47-ную взвесь, в каждую .чашку вносят по 4 мл о взвеси и инкубируют при 37 С в тече- 25 ние 30 мин. Затем чашки тщательно отмывают большим объемом забуференного физраствора для удаления неприклеевшихся к стеклу эритроцитов. Равномерность созданного монослоя проверяют при помощи светового микроскопа.

Исследуют лимфоциты периферичес-кой крови здоровых доноров. В тщательно обезжиренные чашки Петри наливают по 4 мл 0,27-ного раствора

ПДМДААХ, инкубируют 2 ч, после чего раствор сливают, чашки трижды промывают забуференным физиологическим раствором хлористого натрия. Из отмытых эритроцитов готовят 4Х-ную взвесь, в каждую чашку вносят по

4 мл взвеси и инкубируют при 37 С в а

397 г течение 30 мин. Затем чашки тщательно отмывают большим объемом забуференного физраствора для удаления неприкрепившихся эритроцитов. Монослой используют для определения количества клеток, обуславливающих антителозависимую цитотоксичность (К) и естественную (ЕК).

Для определения К-клеток монослой. в течение 30 мин обрабатывают кроличьей антисывороткой против эритроцитов барана с преимущественным содержанием IgG. По истечении срока инкубации чашки трижды промывают забуференным физраствором и наливают по 4 мл культуральной среды (199, мономицин 1000 мкг/мл, 17 сыворотка 1У (AB) группы человека, 0,5Х HEPES) содержащей 0,5-1,0 х10 кл./мл. Мононуклеарные клетки вы6 деляют на одноступенчатом градиенте фиколл-верографина с удельным весом

Э

1 077 г/см . Чашки с клетками инФ о кубируют 18 ч при 37 С и атмосфере

СО . Затем монослой клеток фиксируют

0,6 -ным раствором глутарового альдегида, окрашивают азур-11эоэином и изучают под световым микроскопом.

Подсчитывают 500 лимфоцитов, выделяя среди них клетки, образующие вокруг себя зону гемолиза-бляшку, соответствующую не менее 10 эритроцитам. Результаты выражают в процентах и абсолютных числах на 1 мкл крови.

Чашки с монослоем эритроцитов, не покрытых антителами, служат для подсчета ЕК-клеток. При изучении количества К- и ЕК вЂ клет у 10 здоровых доноров в возрасте 19-31 года установлено, что количество К-клеток равно 1,59+0, 13 (30,8+ 1,5 в мкл), ЕК-клеток к эритроцитам барана—

0,8+0,157 (16,5+3,1 в мкл).