Способ исследования хромосомного состава клеток

 

СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ .ХРОМОСОМНОГО СОСТАВА КЛЕТОК путем разрушения клеток с последующей регистрацией импульса флуоресценции каждой хромосомы, отличающийся тем, что, с целью поШ)Шения информативлости способа за счет поклеточного анализа хромосом, разрушение клеток проводят пропусканием их через капилляр диаметром, соответствующим диаметру клетки, далее регистрируют интервалы времени между импульсами флуоресценции и по величинам интервалов 3-10 мс между импульсами определяют хромосомы, принадлежащие одной клетке.

COfOa СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК (19) (И) (Ю4 601 N 33 483, II3

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ а

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3557845/28-14 (22) 11.01.83 (46) 23.09.87. Бюл. N- 35 (71) Ленинградский институт ядерной физики им. Б.П.Константинова (72) С.И.Степанов (53) 616.07 (088.8) (54) (57) СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ ХРОМОСОМНОГО СОСТАВА КЛЕТОК путем разрушения клеток с.последующей регистрацией импульса флуоресценции каждой хромосомы, отличающийся тем, что, с целью повышения информативности способа за счет поклеточного анализа хромосом, разрушение клеток проводят пропусканием их через капилляр диаметром, соответствующим диаметру клетки, далее регистрируют интервалы времени между импульсами флуоресценции и по величинам интервалов 3-10 мс между импульсами опре деляют хромосомы, принадлежащие одной клетке.

1200б76

25

35

55

Изобретение относится к области автоматизированного анализа биологических микрообъектов, в частности к способам быстрого анализа хромосомного состава клеток.

Целью изобретения является повышение информативности способа за счет поклеточной регистрации хромосом.

Способ осуществляют следующим образомм.

При пропускании потока клеточной пробы клетки проходят через устройство разбиения. В простейшем случае оно представляет собой капилляр, в котором клетки разбиваются гидродинамическими силами. Для этой цели возможно также использование ультразвукового облучения . В устройство разбиения клетки поступают поочередно. Это достигается уменьшением их концентрации в суспенэии и уменьшением расхода клеточной жидкости до тех пор, пока вероятность одновременного поступления двух клеток не станет пренебрежимо мала. На выходе из устройства разбиения появляются группы хромосом, принадлежащие отдельным клеткам и идущие друг за другом с некоторым пе, рерывом. Далее хромосомы проходят капилляр, в котором происходит увеличение расстояния между хромосомами в группе (длины группы), чтобы регистрирующая электроника успевала заре— гистрировать все хромосомы . Временное распределение клеток, поступающих в устройство разбиения, представляет собой распределение Пуансона.

Плотность распределения временныхпромежутков между клетками (также между группами хромосом) есть P (t)

=T„„ ехр (-t/T), где Т„„— среднее время между прохождением клеток. Распределение хромосом внутри группы также примерно представляет собой распределение Пуансона. Соответствен— но плотность распределения временных промежУтков между хромосомами внутри группы есть P(t)=Т„. ехр(-t/T„ ), где T среднее время между хромосомами в группе. Из капилляра поклеточные-группы хромосом поступают в проточную систему цитофлуориметра.

Флуоресценция хромосом и время между ними анализируются с помощью регистрирующей системы. Начало поступления хромосом от очередной клети определя— ют на основе того, что среднее время между прохождением групп Т „ больше в

30-3000 раз, чем среднее время между хромо сомами внутри группы. Для э того одновременно с регистрацией флуоресценции хромосом тем или иным способом регистрируют и время между им\ пульсами. По спектру распределения времени между импульсами, содержащему оба временных распределения, выби— рают такое граничное время Т,, которое больше, чем времена внутри группы и меньше, чем времена между группами. Примерно оно выбирается как

T, =- Т„, . T,, При определении групп хромосом, принадлежащих определенной клетке, первой хромосомой является та., которая пришла через время, боль— шее, чем Т „

Способ поясняется конкретными примерами.

Пример 1. Метафазные клетки китайского хомячка линии CHEL подвер— гают предварительной обработке с целью окраски и облегчения последующего разрыва клетки и расхождения хромосом. Клетки в суспензии выдерживают для набухания в гипотоническом растворе (75 мМ КС1) 20 мин. Затем их обрабатывают раствором состава: де— тергент УГритон "Х-100" -О,ЗЕ, 1 MM

MgC1 ; 1 мМ СаС1: 20 мг красителя этидий бромид, 25 мМ КС1, 25 мМ

Tris-НС1. Раствор имеет рН=7,0 .Время обработки 15 мин. Затем клеточную суспензию с концентрацией не более

10000 клеток в мл осторожно, не допуская преждевременного разрыва их, заливают в насос проточного цитофлу— ориметра. Из насоса поступает 2050 клеток в. с. Далее клетки проходят через устройство разбиения, представ— ляющее собой капилляр диаметром 100150 мкм, длиной 50 мм. Затем подклеточные группы хромосом проходят через капилляр длиной 60 мм, диаметром

0,3 мм. Капилляр увеличивает длину групп (среднее время между хромосомами внутри группы при этом увеличивается до 0,1 мс). Затем хромосомы поступают в проточную систему цитофлуориметра. Флуоресценция, пропорциональная количеству ДНК в хромосоме, поступает на систему регистрации . Одновременно этой систеМой также. регистрируется время между импульсами. Из распределения времени между импульсами определяется граничное время T, . Здесь оно составляет 3 мс.

Регистрирующее устройство производит

Составитель М. Васильев

Редактор П. Горькова. Техред M.Äèäûê Корректор С.!Чекмар

Заказ 4358 Тираж 776 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д .4/5

Производственно-полиграфическое предприятие,г.Ужгород,ул.Проектная,4 з 12006 также подсчет хромосом в каждой клетке. Подсчет хромосом в очередной клетке начинается с хромосомы, время прихода которой по отношению к

5 предыдущей превышает граничное время (3 мс) и оканчивается той хромосомой, следующая за которой приходит через время, большее, чем граничное. Регистрирующая система, используемая 10 здесь, состоит из амплитудного анализатора и набора стандартных электронных блоков.

Анализ распределения числа хромосом в клетках, описанный в этом примере, производится со- скоростью 2050 клеток в с и не может быть выполнен другими известными техническими средствами, например по способу про— тотипа.

Пример 2. Метафазные клети китайского хомячка линии СНЕЬ подвергают предварительной обработке, выполненной так же, как в первом примере. Клеточную суспензию готовят в 25 концентрации 5000 клеток в мл. Из насоса подают 30-100 клеток в с. Далее суспензию пропускают через устройство разбиения, представляющее собой капилляр длиной 40 мм, диаметром 30

100 мкм, внутри которого помещена спираль диаметром 100 мкм. Затем под-. клеточные группы проходят через капилляр диаметром 0,2 мм, длиной

100 мм, в котором осуществляется растяжка длины групп. Импульсы флуоресценции и время между ними регистрируются устройством. Регистрация в данном примере происходит не в виде спектра, а в виде последовательно заполняемых ячеек памяти °

Импульсы флуоресценции хромосом, записанные последовательно по мере их прихода, объединяют в группы, соответствующие хромосомам отдельных клеток. Для этого строят распределение времен между импульсами и выбирают граничное время Т, аналогично примеру 1. Импульсы флуоресценции, отделенные друг от друга временем большим, чем граничное, относятся к разным клеткам. В данном примере гранич ное время составляет 10 мс. Таким образом выделяют группы, в которые включены хромосомы, принадлежащие отдельным клеткам. Из работ по проточной цитофлуориметрии известно, что каждая хромосома располагается на спектре в определенной области флуоресценции. Любые отклонения от этих пределов представляют хромосомные аномалии . Таким образом, если флуоресценция от хромосом попала за пределы этих областей, или внутри области находится лишнее количество хромосом, это указывает на регистрацию аномальных хромосом. В результате этой обработки получается такая информация, как число клеток в пробе с тем или иным числом хромосомных повреждений . Практически это очень важно, так как адекватно характеризует действие, которое оказывают радиоактивные излучения и мутагенные вещества на генетический аппарат клетки.