Способ стимуляции иммунного ответа @ @

 

СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ ИММУННОГО :ОТВЕТА IN VITRO, включающий одновременное добавление в культуру клеток селезенки кролика антигена и иммуностимулятора с последующим учетом количества антителообразующих клеток, отличающийся тем, что, с целью усиления антителообразования, в качестве иммуностимулятора используют пептид с мол.м.500-2000 дальтон, полученный в результате протеолиза папаином фрагмента иммуноглобулина р. щ

СОЮЗ COBETCHHX

СОЦИАЛИСТ ИЧЕСЙ ИХ

РЕСПУБЛИК

„Я0„„1202108 A

gg 4 А 61 К 39/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ 0GCP

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

5 PPl ::"i, .:!! ." 1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТИУ (21) 3757837/28-14 (22) 25.06.84 (46) 15.06.86. Бюл.У 22 (7l) Ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Почетного акад. Н.Ф.Гамалеи (72) А.Я.Кульберг, Л.М.Бартова, Г.У.Маргулис и Й.А.Елистратова (53) 615.375(088.8) (56) Маргулис Г.У. Бартова Л.М., Елистратова И.А., Кульберг А.Я.

Иммунология, 1984, В 5, с.37-49. (54) (57) СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ ИММУННОГО ОТВЕТА IN VITRO включающий одновременное добавление в культуру клеток селезенки кролика антигена и иммуностимулятора с последующим учетом количества антителообраэующих клеток, о т л и ч а ю щ к и с я тем, что, с целью усиления антителообразования, в качестве иммуиостимулятора используют пептид с мол.м.500-2000 дальтон, полученный в результате протеолиэа папанном фрагмента иммуноглобулинаф, 8

0ii4

Ю

Ю

h4

1 120

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, а именно к способам усиления иммунного ответа в культуре клеток (ин витро) in

vitro.

Целью изобретения является усиление антителообраэования клеток селезенки в культуре тканей с помощью F(ab ) -фрагмента иммуноглобулиZ на G.

П р и м е Р l. Получение пептида.

F(ab ) -фрагмент получают перевариванием IgG кролика пепсином в

- 0,05 M ацетатном буфере на 0,15 М о

NaCt, рН 4,1 в течение 18 ч при 37 С, Соотношение фермент-субстрат 1:50.

Полученный гидролизат диализуют против 0,15 М ИаС 1, подвергают хроматографии на колонке с сефадексом

Г-200 и концентрируют на системе

Апйсоп с использованием фильтра

PM-1О.

Полученный Г(аЬ ) -фрагмент диалиI зуют против 0,15 М NaCf рН 7,0 в течение 24 ч при 4 С. Концентрация о белка составляет 1О мг/мл, объем

3 мл. К раствору фрагмента добавляют папаин, 3-кратно перекристаллизованный в 0,05 М фосфатном буфере рН 6,8, содержащем 0,01 М 2-меркаптоэтанол (Яегча). Соотношение фермент-субстрат составляет 1:50. Смесь инкубируют при 37 С в течение 10 ч, затем папаин инактивируют добавлением 0,05 М монойодацетата натрия с последующей инкубацией пробы при

20 С в течение 1 ч. Гидролизат пропусо кают через мембранный фильтр (Diaf1o)

РМ-10 (Amicon). Фильтрат концентрируют с помощью мембранного фильтра

Diaf Fo ИМ-0,5 (Amicon). Оставшийся над фильтром материал исследуют биуретовым методом на содержание пеп2108 2 тида (пептидов), используя в качестве стандарта дипептид глицил-лейцин.

Количество полученного ниэкомолекулярного стимулятора составляло

250 мкг.

Постановка основного опыта.

Клетки селезенки (5 млн/мл) культивируют в среде RPMI-1640 с 10/ной аутологичной сывороткой и в при-9

10 сутствии 5 10 М меркаптоэтанола и глютамина. В каждую культуру вносят по 2,5.10 эритроцитов барана. В опытные культуры дополнительно вно. сят по 5 мкг полученного продукта, который предварительно стерилизуют путем Фильтрации через милипоровый фильтр GSW-p 02500,GS О, 22 М. В другие культуры клеток селезенки кролика вносят по 500 мкг F(ab ) -фрагмента

20 или по 500 мкг высокомолекулярного

I продукта гидролиза F(ab ) -фрагмента папаином, выделенного при хроматографии гидролизата на сефадексе Г-25 (папаиновый Fab-фрагмент). В конт25 рольные культуры добавляют только эритроциты барана. Все культуры стао вят в термостат при 37 С в атмосфере 95 воздуха плюс 5 . СО . Через

5 сут. определяют число антителопродуцирующих клеток по прямому методу локального гемолиза в геле агара.

Положительный эффект изобретения подтверждается данными, приведенными в таблице.

Таким образом, предложенный способ позволяет увеличить антителообразование в культуре клеток селезенки в 100 раз по сравнению с ранее известным.

Способ имеет практическое значение в биотехнологии при разработке метода получения антител в больших масштабах.

1202108

Зависимость количества антителопродуцирующих клеток от типа и концентрации фрагмента

Тип фрагмента

F (аЬ ) 500

FаЪ 500

12 т 1,7

51 + 7,8

Составитель И. Башкаев

Редактор П.Горькова Техред М.Ходаиич Корректор Л.Патай

Тирж 660 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР ио делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Заказ 3318/2

Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул.Проектная,4

Эритроциты барана

5 10 продукт протеолиза

Р(аЪ ) фрагмейта

Концент- Количество рация АОК на фрагмен- 1 млн.-клеток та,мкг/мл

1 - Ot6

8 + 3,5

29 т 2,3