Способ определения активности клеточного иммунитета
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА путем выявления цитотоксического действия сенсибилизированных лимАоцитов на клетки-мишени , отличающийся тем, что, с целью повьпиения точности и ускорения способа, в качестве клеток-мишеней используют гранулоциты после их контакта с убитыми бактериальными клетками, а цитотоксическое действие лимфоцитов выявляют по наличию миелопероксидазы и при увеличении или снижении ее содержания относительно нормы определяют повышение или снижение активности клеточного иммунитета соответственно.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИК (19) (! 1) (5 () 4 А 6 1 К 39/00
Ж);„ . ((.
/):) i.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ н двторсном СвидятедьСтаМ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
fl0 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3614225/28-13 (22) 01.07. 83 (46) 23.09.85. Бюл. ¹ 35 (72) Е.Г.Кирдей, В.Ф.Портнягин и Ю.Д.Коренев (71) Иркутский государственный медицинский институт (53) 615.375 (088.8) (56) Методы изучения in vitro zsrегоvйого иммунитета, — M.: Медицина, 1974, с. 125-133 . (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА путем выявления цитотоксического действия сенсибилизированнык лимйоцитов на клетки-мишени, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и ускорения способа, в качестве клеток-мишеней используют гранулоциты после их контакта с убитыми бактериальными клетками, а цитотоксическое действие лимйоцитов выявляют по наличию миелопероксидазы и при увеличении или снижении ее содержания относительно нормы определяют повышение или снижение активности клеточного
В иммунитета соответственно.
1 118С-, Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки состояния клеточного иммунитета у больных с различными инфекционными заболеваниями в
Цель изобретения — повышение точности и ускорение способа.
Способ осуществляют следующим образом. 10
Производят забор крови у больного в количестве 15-20 мл на гепарине (20 ЕД в 1 мл). Из полученной крови выделяют лимфоциты путем фракционирования на одном из общеупотребляе- 15 мых градиентов плотности. Лимфоциты трижды отмывают в растворе Хэнкса с
207. гидролиэата лактальбумина (центрифугирование при 100 g в течение
5-10 мин) и суспендируют в среде культивирования в концентрации
0 5-1 0 в 1 мл. Полученную взвесь т
Э о до использования хранят при 0-4 С.
Для получения клеток-,мишеней производят забор крови у здорового чело-25 века 0 1 группы в количестве 15-20 мл на цинтроглюкофосфате. К половине объема этой крови добавляют взвесь бактерий — возбудителей заболеваний, убитых прогреванием при температуре, губительно действующей на данные микроорганизмы. К остальной части крови добавляют взвесь убитых таким же образом сапрофитных бактерий, которые используются в качестве контрольных антигенов. При выборе конт35 рольных антигенов руководствуются отсутствием сенсибилиэации организма человека к этим бактериям и принадлежностью их к тому же семейству, 40 что и возбудитель заболевания ° Взвесь убитых бактерий добавляют к крови в
8 конечной концентрации 0,5-1 10 в
1 MJI ° ду °
Инкубацию проб производят в пенициллиновых флаконах при 37оС в газо- вой среде, состоящей из 57 углекислого газа и 953 атмосферного воздуха.
Все манипуляции проводят с соблюдением стерильности. Через 4-5 ч производят центрифугирование проб при
100 g в течение 10-15 мин и в надосадочной жидкости определяют пероксидазную активность. Для этого готовится 0,1Х-ный раствор солянокислого бензидина в ацетатном буфере (pH 4,6) и ЗЕ-ный раствор перекиси водорода в дистиллированной воде. К 2 мл раст:вора бензидина добавляют 0,1 мл раствора H О и О, 1 мл надосадочной жидкости культур. Через 2-3 мин раэвиКровь с бактериями инкубируют в течение 20-30 мин при 37 С. После о этого для остановки фагоцитоза добавляют колхицин до конечной концентрации 20-25 мкг в 1 мл и продолжают инкубацию в тех же условиях в течение того же времени. Затем иэ крови с возбудителями заболевания и с бактериями — контрольными антигенами выделяют гранулоциты. Для этого, осаждают эритроциты добавлением желатина до конечной концентрации о
0,8-17 и инкубацией при 37 С в течение 20 мин, а полученную плазму
01 2 с лейкоцитами фракционируют на том же градиенте плотности, который ис— пользуется для выделения лимфоцитов.
Выделенные гранулоциты обрабатывают
0,84 -ным раствором хлорида аммония для разрушения оставшихся эритроцитов, трижды отмывают в растворе
Хэнкса с 207. гидролизата лактальбумина и суспендируют в среде культивирования в конечной концентрации
0 5 1 10 в 1 мл. б
Культивирование клеток производят в среде 199, содержащей 20K гидролизата лактальбумина, 10Х инактивированной нормальной человеческой сыворотки АВ 1У группы крови без следов гемолиза, пенициллин 100 ЕД и стрептомицин 100 мкг в 1 мл.
К 1 мл взвеси лимфоцитов больного добавляют 1 мл взвеси гранулоцитов здорового человека, незавершенно профагоцитировавших бактерий возбудители заболевания. В качестве контроля к 1 мл взвеси тех же лимфоцитов добавляют 1 мл взвеси тех же гранулоцитов, незавершенно профагоцитировавших бактерий — контрольные антигены. Помимо опытных и контрольных проб производят культивирование отдельно взятых гранулоцитов, профагоцитировавших возбудителей заболевания или контрольные антигены с добавлением равных объемов среды культивирования для определения степени спонтанного лизиса клеток-мишеней.
Для оценки полного лизиса клетокмишеней гранулоциты, профагоцитировавшие опытные или контрольные антигены, помещают в соответствующих концентрациях в дистиллированную во1180001 4 способом, отражает степень сенсибилизации цитотоксических лимфоцитов
° антигенным комплексом возбудителей заболевания и их способность разрушать клетки-мишени, содержащие возбудитель, т.е. по данному пок",çàòåлю оцениваются протективные свойства клеточного иммунитета по отношению к возбудителю и в целом — активность его при данном заболевании.
Пример 1. Определение активности клеточного иммунитета по цитотоксическому действию лимфоцитов производят у здоровых людей по отношению к патогенному стафилококку (Штамм Вууд-46).
В качестве контрольного антигена используют сапрофитного представителя того же семейства Mkcrococcus
1ysodeicticus (штамм 2665) . Взвесь стафилококков и микрококков прогрео вают при 60 С в течение 30-35 мин и добавляют к крови в конечной концентрации 1 10 вается голубая окраска, интенсивность которой оценивают фотоэлектроколоримеурически или спектрофотометрически.
На основании полученных данных вычисляют количество клеток-мишеней, разрушенных в опытных и контрольных пробах, с учетом спонтанного лизиса и по отношению к показателям полного лизиса мишеней (Л) по формуле f0
Е < — F.z — — — — — — ° 1007
Е о з где Š— показатель пероксидазной
f активности в пробах с опыт- 15 ными или контрольными клет ками-мишенями и лимфоцитами больного;
Š— показатель пероксидаэной
2 активности в пробах с изо- Zp лированными опытными или контрольными клеткамимишенями;
F. — показатель цитотоксической 3 активности в пробах с пол- 25 ным разрушением опытных или контрольных клетокмишеней.
Цитотоксическую активность лимфоцитов больного по отношению к возбудителю заболевания оценивают по разнице между показателями лиэиса клеток-мишеней в опытных пробах и аналогичным показателем контрольных проб. Выполнение способа занимает не
35 более 8-9 ч.
Цитотоксическая активность лимфоцитов, определяемая предлагаемым
Время инкубации, ч
Показатель цитотоксической активности, 7
12,4+3,5 23, 12+2, 1 21,4+2,5 22, 2+2,3 19,3 +3,6 шения клеток-мишеней под действием цитотоксических лимфоцитов.
Пример 2. Определение цитотоксической активности лимфоцитов по отношению к патогенному стафилококку производят у больных с абсце;дирующиыл пневмониями стафилококко вой Угиологии, подтвержденной бактериологически. Определение указан
Как видно из таблицы, показатель цитотоксической активности достигает максимума через 4 ч инкубации лимфоцитов с клетками-мишенями и в последующие сроки культивирования держится на том же уровне. Следовательно, в предлагаемом способе время инкубации 4-5 ч определяется оптимальным для максимального раэруЛимфоциты получают из крови здоровых людей — доноров крови, клеткимишени получают также из крови здоровых людей 01 группы. Культивирование опытных и контрольных проб, а также отдельно взятых клеток-мишеней производят при 37 С в соответствуюо щей газовой среде в течение 3, 4, 5, Я и 16 ч. Показатели цитотоксической активности лимфоцитов здоровых людей по отношению к патогенному стафилококку, определяемые в различные сроки культивирования, представлены в таблице.
1180001
Составитель Г.Крюкова
Редактор Л.Зайцева Техред А.Кикемезей Корректор И.Муска
Заказ 5782/3 Тираж 721 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5
Филиал ППП "Патент", г.Ужгород, ул.Проектная,4. ного показателя производят аналогично примеру 1.
Больной К. Диагноз: правосторонняя верхнедолевая абсцедирующая пневмония.
В пробах с опытным антигеном:
Е< = 0,113, Ez 0 036 Ез = 0,380.
Аап = (О» 113 Оэ 035): Оэ 380 100
= 20,6Х.
В пробах с контрольным антигеном:
Е, = 0,05, Е2 = 0,032, Е = 0,360.
Ак 0 05 0 032) 0 36 100 5 1
А „- Ак = 20,6 — 5,1 = 14,5Х.
Показатель цитотоксической активности лимфоцитов по отношению к стафилококку составляет 14,5Х.
Больной Н. Диагноз: правосторонняя верхнедолевая абсцедирующая пневмония. Клиническое течение характеризуется быстрой в течение 5 дн. норм чизацией температуры тела, прекращением отделения мокроты в тот же срок, быстрым уменьшением воспалительной инфильтрации и уменьшением размеров полости, выявляемых рентгенологически.
В пробах с опытным антигеном:
E ) = 0,223, Е = 0,048, Ез = 0,410.
Аоп= (О 223 0,048): 0,41 100X
= 42,8 .
В пробах с контрольным антигеном:
Е1 = 0 060, Ez = 0 049, E> = 0 430.
Ак = (О 060 0 049):0,430 100X =
2 5Х Аоп А к = 42 8 2 5%
= 40,3Х.
Показатель цитотоксической активности лимфоцитов по отношению к стафилококку у больного увеличен до, 40,3Х.
Приведенные примеры свидетельствуют о том, что у больного с неблагоприятным течением заболевания наблмдается снижение цитотоксической акt0 тивности лимфоцитов по сравнению со здоровыми людьми и интенсивность этого снижения отражает степень тяжести заболевания. Благоприятное . течение заболевания сопровождается
15 повышением цитотоксической активности лимфоцитов по отношению к стафилококку.
Проведение параллельных определений цитотоксической активности лим20 фоцитов здоровых людей и больных хроническим тонзилитом предлагаемым и известным способами по отношению к гемолитическому стрептококку или его аллергену (растворимому антиге25 ну) позволяет заключить, что предложенный способ обладает более высокой точностью в сравнении с известным.
В частности, с помощью предлагаемого
0 способа удается выявить более глубоЗО кие изменения цитотоксической активности лимфоцитов по отношению к гемолитическому стрептококку в 66,6+
12,4 случаев, а степень повьппения точности в сравнении с известным составляет 3 1,6+ 11,2 . Постановка реакции занимает всего 4-5 ч.
