Способ получения иммобилизованных клеток дрожжей @ @ n112, обладающих l-лизинамидазной и l- @ - аминокапролактамгидролизной активностями

 

СО1ОЭ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

А1

„„SU„„123914

4CГ(. .чрр-.;„, 13" р

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И 0THPblT (21) 3793622/28-13 (22) 25.09.84 (46) 23.06.86. Бюп. У 23 (71) Научно-производственное объединение "Фермент" (72) Г.И. Микшите, А;А. Дикчювене, А.-А.Б. Паулюконис и Д.А. Казлаускас (53) 577.15(088.8) (56) Введение в прикладную знзимологию./Под ред. И.В. Березина, М.: МГУ, 1982, с. 134-141.

Патент США Ф 4208482, кл. С 12 N t 1/00, опублик. 1980. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ CRYPTOCOCCUS

SPECIES Ф tt2, ОБЛАДА10ЩИХ L-ЛИЗИНАМИ- (50 4 С 12 N 11/00 // (С,12 N 11/00;

С 12 К 1:00

ДАЗНОЙ И L-о(-АМИНОКАПРОЛАКТАМГИДРОЛИЗНОЙ АКТИВНОСТЯМИ, путем включения клеток в агаровый гель, обработки глутаровым альдегидом и получения гранул, отличающийся тем, что, с целью увеличения ферментативной активности и стабильности иммобилизованного препарата, включение клеток в гель проводят путем смешивания раствора, содеркащего агар в концентрации 1,7-2,6Ж и полиэтиленимин в концентрации 3,4-3,9Х с клетками в количестве 160-180 мг на 1 мл раствора агара и полиэтиленимина, а после получения гранул их обрабатывают 0,91,2Х-м раствором глутарового альде- Ж гида.

123

Изобретение относится к биотехноб- логии, а именно к способам иммобилизации клеток дрожжей, обладающих Lлизинамидазной и L 4 -аминокапролактамгидролазной активностями, и предназначено для получения биокатализа— тора, который может быть использован в технологическом процессе производства L-лизина из DL-лизинамида или

DL- -аминокапролактама.

Цель изобретения — увеличение ферментативной активности и стабильности препарата.

Бифункциональный реагент, а именно глутаровый альдегид, легко вступает в реакцию со свободными аминогруппами. При этом образуются прочные ковалектные связи между отдельными молекулами полиэтиленимина через глутаровый альдегид. В такую цепь могут быть включены свободные аминогруппы, находящиеся на поверхности клеточной стенки или мембраны. Такая "сшивка" становится препятствием для вымывания клеток из гранул агарового геля и это приводит к повышению фермента.тивной стабильности препарата иммобилизованных клеток. Кроме того, после обработки гранул иммобилизованного препарата раствором глутарового альдегида определенной концентрации повьпнается их механическая прочность. Повышение ферментативной активности препарата достигается благодаря увеличению весового соотношения клетки (гельобразующие материалы, которые по предлагаемому способу иммо- билизации составляют 1,6/0,6, а по известному 1,0/1,0). Предварительная обработка суспензии клеток раствором глутарового альдегида приводит к потере ферментативной активности на 40%. Препарат иммобилизованных клеток, полученный в отсутствие колиэтиленимина, после обработки глутаровым альдегидом теряет ферментативную активность на 35%. Только присутствие полиэтиленимина в препарате иммобилизованных клеток делает возможной обработку глутаровым альдегидом практически без потери ферментативной активности. Оптимальные концентрации агара, полиэтиленимина, клеток и глутарового альдегида, найденные путем планирования экспериментов симплексметодом, необходимо поддерживать на указанном уровне для увеличения актив ности и стабильности целевого продукта.

П р и м е p . Способ иммобилизации клеток в оптимальных условиях.

0,75 мл 50%-ного раствора полиэтиленимина растворяют в 7-8 мл воды

> (pH,öoâoäÿò до 8,5 прибавлением 1 н.

НС1), прибавляют 0,22 г агара, объем смеси доводят водой до 10 мл и подоо гревают до 80 С для полного растворения. Смесь охлаждают до 50 С, прибаво

10 ляют 1,6 r сухих клеток, перемешивают и охлаждают льдом и водой до 5 С °

Образовавшийся блок геля с включенными клетками измельчают продавливаиием через сито и полученные гранулы ломе15 щают в стакан с 50 мл 1%-ного раствора глутарового альдегида. После контактирования смеси в течение 20 мин о при 4-6 С гранулы промывают дистиллированной водой. Получают препарат им20 мобилизованных клеток, который обладает L- о -аминокапролактамгидролизной активностью 160 Е/мл, L-лизинамидазной — 158 Е/мл. Единица ферментативной активности — количество фермента, 25 образующего 1 мкмоль лизина в минуту.

Активность биокатализатора рассчитывают на сухой вес препарата. Активность в Е/мл получают делением значения активности на сухой вес (Е/г) на

Зр величину набухаемости (мл/г).

Результаты опытов 1-9 (из серии экспериментов, выполненных при оптимизации способа иммобилизации методом симплекс-планирования), показывающие влияние изменения концентраций исходных материалов на ферментативную активность и выход иммобилизованного препарата, приведены в табл. 1.

При неодинаковой исходной концент1О рации клеток наиболее характерным показателем эффективности процесса иммобилизации является выход ферментативной активности. Опыты 1 и 2 показывают приемлемые пределы изменения концентраций полизтиленимина, агара

45 и глутарового альдегида. Препарат, полученный в опыте 3, механически непрочен (легко распадается на мелкие частицы при перемешивании), поэтому

50 указанная концентрация глутарового альдегида является непригодной (слишком малой), Выход ферментативной активности уменьшается, если концентрации полиэтиленимина и агара недостаточны (опыт 4). Отрицательное влияние на выход ферментативной активности оказывает повьппение концентраций полиэтиленимина, агара и глутарового альдегида до значений, представленных

Таблица 1

Набухае- Выход

1 мость фермантаиммоби- Iтивной лизован- активносного пре 1 ти, Е парата, мл/г

L- -аминокапролактамгидролазная

КонцентКонцентрация клеток, мг/мл

Концент- Концентрация рация агара, полиОпыт рация глутарового активность иммобилизованного

7. этилен ! имина,, мг/мл альдегида, 7 препарата, Е/r Е/мл

3,8

139

533

0,9

3,4

135

1 1,8

2 2,6

3 2,6

4 1,5

5 3,0

3,9

3,5

141

495

1,2

135

430

90

0,3

3,9

3,8

79

102

388

1,2

3,1

3,6

78, 281

1,5

100

4,2

3 239 в опыте 5. Уровень активности биокаталиэатора зависит от концентрации иммобилизуемых клеток (опыты 6-9).

Гель "насьпцается" клетками при их концентрации 160-180 мг/мл,и дальней- 5 шее повышение исходной концентрации клеток ведет к понижению выхода ферментативной активности..

Для определения L- 4 -аминокапролактимгидролазной активности в термоста- 1О тируемую при 50 С ячейку, перемешиваемую магнитной мешалкой, помещают

3 мл 0,1 М раствора субстрата Ь-с — аминокапролактама, ° рН 8,0, к которому прибавляют препарат иммобилиэованных клеток. После 1-2 мин переме-! . шивания берут контрольную пробу для определения фоновой концентрации лизина. Длительность ферментативной реакции 30 мин. Содержание лизина в пробах определяют фурфурольным методом.

В случае определения лизинамидазной активности ферментативную реакцию проводят аналогично. В качестве субстрата используют 0,1 М раствор

L-лизинамида. Пробы контроля и ферментативной реакции обрабатывают реактивом, содержащим фурфурол, и измеряют оптическую плотность окрашен-. ного продукта реакции при волнах дли,ной 370 и 430 нм. Концентрацию лизина определяют по калибровочному граФику зависимости разности оптической плотности А1<1 "А д от концентрации лизина в калибровочной смеси, содер35 жащей лизин и лизинамид.

)48 4

Для определения стабильности иммобилизованных клеток через термостатируемые при 50 С колонки, заполнено ные испытуемыми препаратами, со скоростью 12 мл/ч прокачивают О, 1 M раствор Ь-лизина рН 8,25 (консерванттолуол). Через определенные интервалы времени извлекают образцы препаратов, хорошо отмывают водой и определяют остаточную активность.

Данные о препаратах иммобилизованных клеток Cryptococcus species Ф 112, полученных по предлагаемому и известному методам, представлены в табл. 2. Приведенные данные получены в параллельных опытах, выполненных с использованием одной партии клеток

Cryptococcus species Ф 112.

Результаты табл. 2 показывают, что при использовании предлагаемого способа ферментативная активность полученного препарата иммобилизованных клеток Cryptococcus species Ф 112 увеличивается в 5 раз; способ существенно повышает ферментативную стабильность препарата, т.е. в тесте стабильности при 50оС в течение 20 сут начальный уровень активности остается 100Х-ным (согласно известному способу — 20X).

Увеличение активности и стабильности приводит к существенному увеличению продуктивности биокатализатора и снижению себестоимости продукта ферментативной реакции Ь-лизина. 1239148

Продолжение табл ° 1

Выход фермента тивной

Набухаемость иммобиКонцент= рация полиКонце нт рация клеток, мг/мл

Опы нцентция ара, активности, % этиленимина, лизованальдегида, % препарата, ного препарата, мл/г мг /мл

Е/r Е/мл

6 2,2

155 3,4 91

160 3,4 91,5

1,0

3,7

150

530

7 2,2

3,7

160

1,0

543

1,0

3,4 89

8 2,2

9 2,2

3,7

180

545

f60

3,7

200

1,0

545

160

3,4

Таблица 2

Показатель

Предлагаемый Известный способ способ

L-Лизинамидазная активность

Е/г

537

370

Е/мл

Ь- î(-Аминокапролактамгидролазная активность

158

Е/r

544

376

Е /мл

Набухаемость, мл/г

3,,4

11,6

Остаточная активность, %

0 ау при 50 С в тесте стабильности через:

2 сут

100

56

100

f00

100

ФО

50

ВНИИПК Заказ 3354/21 Тираж 490 . Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, r. Уикгород, ул. Проектная, 4

5 сут

12 сут

18 сут

20 сут

32 сут

50 сут

Концент- Ь-< --аминокапрорация лактамгидролазная глутаро- активность иммового билизованного