Способ определения коэффициентов задержания микрофильтрационных мембран

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСГ1УБЛИН

1511 4 С 12 Q 1/00, R 01 D 13/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ д

Н A BTQPCHQMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3592394/28-14 (22) 28.03.83 (46) 30.07.86.Бюл. У 28 (71) Всесоюзный научно-исследова— тельский институт особо чистых био— препаратов (72) А.Е.Полоцкий, Н.Б.Иванов, В.П.Жемков, А.Н.Черкасов, В.И.Гро мов и В.Е.Михайлов (53) 663.66(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

Р 1017734, кл. С 12 Q l/00, 20.08.81.

„„SU„, 1247420 А 1 (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЭФФИЦИЕНТОВ ЗАДЕРЖАНИЯ МИКРОФИЛЬТРАЦИОННЫХ МЕМБРАН путем пропускания через мембраны калибровочного раствора, содержащего белки, анализа фильтрата и концентрата методом гель-хроматографии, вычисления коэффициентов задержания, отличающийся тем, что, с целью повьппения точности определения, в калибровочный раствор дополнительно вводят биологические частицы в концентрации 2 х х 1Π— 4 10 " 1/см

7 12474

Изобретение относится к физической химии, а именно к процессам мем-. бранного разделения биологических суспензий калибровки микрофильтрационных мембран. 5

Цель изобретения — повышение точности определения коэффициентов за-. держания микрофильтрационных мембран — достигается эа счет более точного моделирования реальных процессов разделения биологических суспензий в результате добавления в калибровочный раствор биологических

8 частиц в концентрации 2 10 -4 х, х 10 1/смэ. 15

Калибровочный раствор, содержа-. щий смесь белков и амикокислоти/или пептидов с ММ 200 — 240000 дальтон, в концентрациях 0,05-6,7 мг/мл и би— ологические частицы (вирусы, бакте- 20 рии и т.ц.) в концентрации 2 10

4 10" 1/см, фильтруют через мембрану (ацетилцеллюлозкые мембраны типа Биопор, полиамидные, ядерные лавсановые фильтры).

В начальный период процесса и после концентрации (К) отбирают пробы фильтрата и концентрата (по 0,4мл каждого) и анализируют концентрации их компонентов гель-хроматографией ЗО на колонке, наполненной ультрагелем

АсА-34, при скорости элюции 3,5—

4 см"/ч. После этого по площадям (высотам) соответствующих гель-хроматографических пиков находят коэф1 фициент задержания согласно формуле

Ч=-1--—

С р, (1)

c„; где С, и C,— концентрации i-го компонента в фильтрате и концентрате, выраженные в единицах площади (высоты пиков на хроматограмме), П р .I м е р 1. Калибровочную смесь объемом 100 мл, представляющую собой раствор триптофана (M=204,C=0,05 мг/мл) химотрипсикогена (М=24 тыс.), яичного (М=44 тыс..) и человеческого сывороточного (М--67 тыс1 альбуминов, g -глобулина (М=160 тыс.), каталазы (М=240 тыс.) концентрации каждого 0,4 мг/мл и частиц вируса

10 3 гриппа в концентрации 10 1/см фильтруют в ячейке с механическим перемешкванием через ацетатцеллюлозную мембрану Биопор М-0,1. Средний диаметр пор 1000 А, После пропускания

90 мд в фильтрат (K=10) отбирают пробы фильтрата и концентрата, которые

20 анализируют на гель-хроМа Toãðaôè÷eñкой колонке О, 9х60 см, наполненной ультрагелем АсА-34, при скорости элюцки 4 см /ч. По гель-хроматограммам з фильтрата и концентрата согласно формуле (1) были рассчитаны коэффициенты задержания в зависимости от молекулярного веса (например, для веществ с мол.вес.59000-10000 1 =0,9-0,95).

По способу-прототипу расчетные данные были существенно занижены — вещества с указанными молекулярными весами преходили полностью.

В таких же условиях ка указанной мембране фильтровали вируссодержащую аллактоисную жидкость с концентрацией вирусoB 10 1/см, общим содержани)(3 ем белка 1,6 мг/мл, содержанием овальбумина 0,9 мг/мл и концентрировали в

10 раз. При этом концентрация овальбумина возросла до 8 мг/мл, что cQ ответствует 1 =0,95, а белок с мол. мас. 60 тыс.дальток задерживался пол— костью, что согласуется с расчетными данными, 1

D р и м е р 2. Калибровочную смесь объемом 2000 см, представляющую со3 бой исходную культуральную жидкость

Serratia NarcesceIIs с концентрацией бактерий 2х!0 1/см с добавлением

Д пепсина (8=35 тыс.дальтон) в концентрации 0,,5 мг/мл, фильтруют ка аппарате типа фильтр-пресс, снабженном мембранами Биопор М-0,1, с обшеи поверхностью фильтрации 4000 см", После достижения 10-кратной степени концентрирования отбирают фильтрат и концентрат и анализировали их гельхромя.тографией ка содержание пепсина.

По формуле (1) был рассчитан коэффициент задержания пепсина, который был равным 0,03. На этом же аппарате проводил:ась микрофильтрацкя реальной культуральной жидкости Serrat:ia Марв сезсепз с концентрацией бактерий

2xl0 1/см, содержащей цслевои фер— мент эндонуклеазу (MM 30-36 тыс, дальтон) . После достижения 10-кратной степени концентрировакия отбирали пробы фильтрата и концентрата, которые тестировались на содержание экдокуклеазы по гидролизу высокополимерной PHK и по отношению активностей в фильтрате и концентрате согласно формуле (1) был определен коэффициент задержания экдокуклеазы

Ч =0,05, который согласуется с У пеп247420

При различных степенях концентрирования, концентрациях белка (26,7 мг/мл) и вируса гриппа (4 х х 101" 1/см ) согласно методике прид / мера 1 при скорости элюции 3,5 см /ч были определены коэффициенты задержания указанных белков, которые оказались равными: %,=0,20+0,05;

Содержание общего белк по Лоури,мг/мл, Штамм вируса

Содержание овалбумина мг/мл

Стадия получения вакцины

Рассчет Опыт Расчет Опыт

А /Техас

После 11-кратного концентрирования 0,337-0,645 0,460

107-173

После диафильтрации, кратность

Полуфабрикат

0,160-0,323 0,242 0,08-1,4

0,070

0 5

0,07» ф

Согласно ТУ И2.14.149-78 на полуфабрикат гриппозной вакцины коцентрация общего белка не должна превышать 0,15 мг/мл, концентрация овальбумина

1 мкг/мл.

Составитель А.Переверзева

Техред Б.Кадар Корректор Г.Решетник

Редактор Ы.Келемеш

Заказ 4080/26 Тираж 490 По дписно е

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб .. д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 l сина, имеющего близкую к эндонукле— азе молекулярную массу.

Пример 3. Калибровочную смесь объемом 2000 см, представля— ющую собой раствор молочного альбумина, яичного альбумина, человеческого сывороточного альбумина, -глобулина с начальными концентрациями по 0,5 мг/мл каждого и вируса грип<0 3 па начальной концентрации 2х10 1/см фильтруют на аппарате типа фильтрпресс, снабженного мембранами Биопор

AN (d=350 Р. ) с рабочей поверхностью

400 см

Ч2= 0,5 - 0,1; Ч, =0,58+0,10; Ч =0,67

t O$1 j

По результатам калибровки мембраны Биопор-Ам (по коэффициенту задер5 жания овальбумина М . 0,5+0,1 — лимитирующий фактор) были рассчитаны параметры процесса мембранной очистки вируссодержащей алантоисной жидкости, необходимые для получения стан— дартной гриппозной вакцины. Соглас— но расчетам было получено: степень коцентрирования 10 — 15, кратность диафильтрации 10-12. Проведенная наработка опытных партий вакцин пв расчетной технологии позволила полу— чить продукт, удовлетворяющий ТУ как по овальбумину, так и по общему белку, и показала хорошее совпадение расчетных и экспериментальных данных .

Сравнение экспериментальных и расчетных данных в процессе получения гриппозной вакцины приведено в таблице.