Способ твердофазного синтеза дезоксиолигонуклеотидов

 

Изобретение касается нуклеотидов , в частности дезоксиолйгонуклеотидов (НУК), используеьшх в биотехнологии . Способ твердофазного синтеза НУК ведут конденсацией фиксированного на полимерной матрице защищенного нуклеозида или олигонуклеотида со свободной З -гидроксильной группой с 3 -п-хлорфенилфосфатами защищенных нуклеозидОБ, взятых в 620-кратном избытке, в среде абсолютного растворителя - пиридина, в присутствии конденсирующего агента 1 -(мезитиленсульфонил)-3-нитро-1,2,4-триазола . и катализатора - смеси калиевой соли.3-нитро-1,2,4-триазола с I8-крауном-6 в молярном соотношении 1:1, причем молярное соотношение З -П Хлорфенилфосфата, конденсирующего агента и катализатора составляет 1:

СООЗ COBETCHHX

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

КСГ1УБЛИН

„.80„„1265196

А1 (gg 4 С 07 Н 2!/04

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К AST0PCH0MY СВИДЕТЕЛЬСТВУ 1 т 1 1ЭММВ", (2l) 3850742/23-04 (22) 06.12.84 (46) 23.10.86. Бюл. В 39 (7l) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии (72) А.Н. Синяков и Н.Н. Карпышев (53) 547.963.32.07(088.8) (56) Добрынин В.Н., Филлипов С.А., Быстров Н.С., Северцова И.В. и Колосов М.Н. Катализируемый метилимидаэолом быстрый синтез олигодеэоксинуклеотидов фосфотриэфирным путем на .силикагельном носителе в дихлорэтане. — Биоорганическая химия, 1983, т. 9, Ô 5, с. 706. (54) СПОСОБ ТВЕРДОФАЗНОГО СИНТЕЗА

ДЕЗОКСИОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ (57) Изобретение касается нуклеотидов, в частности дезоксиолйгонуклеотидов (НУК), используемых в биотехнологий. Способ твердофаэного синтеза НУК ведут конденсацией фиксированного на полимерной матрице эащищенного нуклеозида или олигонуклеотиI да со свободной 5 -гидроксильной группой с 3 -n-хлорфенилфосфатами защищенных нуклеозидов, взятых в 620-кратном избытке, в среде абсолютного растворителя — пиридина, в присутствии конденсирующего агента—

1-(мезитиленсульфонил)-3-нитро-1,2,4-триазола и катализатора — смеси калиевой соли З-нитро-1,2,4-триазола с 18-крауном-6 в молярном соотношении 1:1, причем молярное соотношение 3 -n-хлорфенилфосфата, конденсирующего агента и катализатора состав" ляет 1:(3-5):(2-3). Указанный цикл повторяют для наращивания цепи. Выход НУК 53,9Х (93,5Х в расчете на средний цикл нарашивания цепи). Исиспольэование "обнаженного" аниона С катализатора снижает время синтеза продукта при сборке олигонуклеотидов, 2 с длиной цепи более 10 звеньев и в целом повышает выход НУК.

)265

После завершения последнего цикла олигонуклеотид детритилируют, отмы- 4О вают хлороформом (3. 3 мл) и пиридином (3 3 мл) и обрабатывают в течение

36 ч 0,5 М раствором и-нитробензальдоксимата тетраметилгуанидиния в смеси пиридин-вода (7:3). Полимер от- 45 фильтровывают и тщательно промывают пиридином (3 5 мл). Фильтраты объединяют, упариваЮт досуха, растворяют в концентрированном водном аммиаке, выдерживают в этом растворе при 50

20 С в течение 12 ч, обессоливают на биогеле P-2 (Bio-Rad Laboratories, США) и хроматографируют на ионнообменной смоле Partisil 10SAX.

Получают 189,7 о.е. целевого продук- 55 та с общим выходом 53,9 (93,5% в расчете на средний цикл наращивания цепи).

Изобретение относится к химии, более конкретно представляет собой усовершенствованный способ твердофазного синтеза дезоксиолигонуклеотидов, используемых в биотехнологии.

Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта и сокращение продолжительности процесса °

Поставленная цель достигается эа счет использования 1 †(мезитиленсульфонил)-3-нитро-1,2,4-триаэола в качестве конденсирующего агента и калиевой соли 3-нитро-1,2,4-триазола и 18-крауна-6 в качестве катализатора. l5

Пример 1. Получение деэоксиолигонуклеотида d(TTTTTTTTTT).

95 г помещенного в шприц моцифицированного силикагеля (силохром

С"80), содержащего 4 мкмоль 4,4 -ди- щ метокситритилдезокситимидина, (СНЗО)д TrdT, детритилируют 5%-ным раствором трихлоруксусной кислоты в

1,2-дихлорэтане (4>2 мл). Полимер промывают хлороформом (4«4 мл) и аб- 25 солютным пиридином (4"3 мл). Затем к отфильтрованному полимеру добавляют раствор 80 мкмоль 4,4 -диметекситри1 тил-3 -n-хлорфенилдезокситимидина, (СН О) TrdTp(PhC1), 267 мкмоль калиевой соли З-нитро-1,2,4-триазола, 267 мкмоль 18-крауна-6 и 400 мкмоль

1-(мезитиленсульфонил)-3-нитро-1,2,4триаэола в 0,8 мл абсолютного пиридина. Реакционную смесь встряхивают

5 мин, полимер отфильтровывают и промывают хлороформом (4«2 мл). Цикл наращивания цепи повторяют.

196 2

Пример 2. Получение деэокси-, олигонуклеотида d(ATGGTTTTTC).

Детритилируют 83 мг модифицированного силикагеля, содержащего

3,75 мкмоль (СН О)д ТгйС. Детритилирование и конденсацию полимер-дезоксинуклеозида (олигонуклеотида) с 3 -и=

/ хлорфенилфосфатами (PhC1) защищенных дезоксинуклеоэидов, а также выделение целевых продуктов проводят также, как в примере 1. После хроматографирования получают 176,2 о.е. целевого продукта с общим выходом 47,5% (92% в расчете на средний цикл наращивания цепи).

П р,и м е р 3. Получение дезоксиолигонуклеотида d(CACACACATTTTCTCCT).

Детритилируют 73 мг модифицированного силикагеля, содержащего 2,9 мкмоль (СН О) ТгйС. Детритилирование и конденсацию полимер-нуклеозида (олигонуклеотида) с 3 -n-хлорфенилфосфатами защищенных деэоксинуклеозидов проводят так, как описано в примере l, После хроматографирования получают 9! о.е. целевого продукта с общим выходом 18,8% (90 в расчете на средний цикл наращивания цепи). Последовательности дезоксиолигонуклеотидов в синтезированных олигомерах подтверждены стандартным анализом по методу Максама-Гилберта, Пример 4. Получение деэоксиолигонуклеотида А(TTTTTTTTTT).

Детритилируют 95 мг модифицированного силикагеля, содержащего 4 мкмоль (СН О) TrdT. Детритилирование и промывку полимера осуществляют так, как описано в примере 1. Затем к отфильтрованному полимеру добавляют раствор

80 мкмоль (СНЗО) TrdTp(PhC1), 160 мкмоль калиевой соли 3-нитро-1, 2,4-триазола, 160 мкмоль 18-крауна-6 и 240 мкмоль 1-(меэитиленсульфонил)-З-нитро-1,2,4-триаэола в 0,8 мл абс. пириднна. Реакционную смесь встряхивают 5 мин, полимер отфильтро" вывают и промывают хлороформом (4 «2 мл). Цикл наращивания цепи повторяют. Деблокирование и выделение целевого продукта осуществляют так, I как описано в примере 1. После хроматографирования получают 180,1 о.е, целевого продукта с общим выходом

51,2 (92,8 в расчете на средний цикл наращивания цепи).

Пример 5. Получение деэоксиолигонуклеотида, й(CCCCCTTTTTTTA). формула изобретения

Составитель Г. Пальмбах

Редактор Г. Волкова Техред М.Ходанич Корректор С. Шекмар

Заказ 5625/18 Тираж 343 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 1265

Детритилируют 50 мг модифицированного силикагеля, содержащего

3 мкмоль (CH O)z TrcM. Детритилирование и промывку полимера осуществляют так, как описано в примере I, Затем к отфильтрованному полимеру прибавляют 18 мкмоль (СН О)., ГгоТр(РЬС1), 60 мкмоль калиевой соли З-нитро-1,2, 4-тиазола, 60 мкмоль 18-крауна-6 и

90 мкмоль 1-(мезитиленсульфонил)-3- 10 нитро-1,2,4-триазола в 0,18 мл абс. пиридина. Реакционную смесь встряхивают 5 мин, полимер отфильтровывают и промывают хлороформом (4 2 мл).

Цикл наращивания цепи повторяют. Де- 5 блокирование и выделение целевого продукта осуществляют так, как описано в примере l. После хроматографирования получают 112,7 о.е. с общим выходом 33,17. (91,2Х в расчете на средний цикл наращивания цепи).

Использование соотношения полимер

1 дезоксинуклеоэид: 3 -и-хлорфенил— защищенный дезоксинуклеозид меньше, чем 6:1 невозможно по техническим причинам, поскольку для полного смачивания носителя необходимо не менее

150-180 мкл реакционной смеси. Применять избыток P-компонента более, чем

20-кратный, не имеет смысла, поскаль-30 ку. в таком большом избытке он уже не влияет ни на скорость, ни на выход, и расход реагента не рационален.

Принципиальным отличием изобретения является использование в качестве нуклеофильного катализатора реакции конденсации "обнаженного аниона" — З-нитро-1,2,4-триазолия, который образуется при смешивании эквимолярных количеств калиевой соли 40

З-нитро-1,2,4-триазола и 18-крауна-6.

Применять соотношение калиевой соли

З-нитро-1,2,4-триазола и 18-крауна-6

196 4 иные, чем I:1, не имеет смысла, поскольку одна молекула краун-эфира сольватирует один катион калия.

Таким образом, уменьшение времени реакции конденсации в одном цикле приводит к существенному сокращению времени синтеза конечного продукта при сборке олигонуклеотидов с длиной цепи более 10 нуклеотидных звеньев.

Высокий средний выход на один цикл наращивания цепи приводит к значительному повышению выхода целевого продукта. Указанные преимущества позволяют применять изобретение в крупномасштабном синтезе олигонуклеотидов.

Способ твердофаэного синтеза деэоксиолигонуклеотидов путем конденсации фиксированного на полимерной матрице защищенного нуклеозида или (/ олигонуклеотида со свободной 5 -гидроксильной группой с 3 -и-хлорфенилфосфатами защищенных нуклеозидов в абсолютном растворителе, в присутствии конденсирующего агента и катализатора, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и ускорения процесса, конденсацию проводят в пиридине с 6-20-кратным молярным избытком 3 -и-хлорфенилфосфата защищенного нуклеозида, в присутствии

1-(мезитиленсульфонил)-3-нитро-I. 2,4триазола в качестве конденсирующего агента и калиевой соли 3-нитро-1,2,4триазола и 18-крауна-6 в молярном соотношении 1:! в качестве катализатора, причем соотношение между 3 -ихлорфенилфосфатом, конденсирующим агеном и катализатором в молях составляет 1:(3-5):(2-3).