Способ модификации дезоксирибонуклеиновой кислоты

 

ИИааьа(. "X3N4iu0L5 бабааМ41КВ ЫЬА

Союз Советсннх

Соцналнстнчесмнх

Республик

О П

ИЗОБРЕТЕНИЯ

<»1 732276

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. сеид-ву (22) Заявлено 1712.76 (21) 2430224/23-04 с присоединением заявки Ио (23) Приоритет

Опубликовано 05,0580, Бюллетень )(о 17 (51)М. Кл.

С 07 Н 21/04II

A 61 К 31/70

Государственный комитет

СССР но дедам изобретений и открытий (53) УДК 547.963. ,32.07(088.8) Дата опубликования описания . 080580 (72) Авторы изобретения

Е.Н. Коломыйцева, Ю.A. Семин и А,М. Поверенный (71) Заявитель

Научно-исследовательский институт медицинской радиологии

AMH СССР (5 4 ) СПОСОБ МОДИФИКАЦИИ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОЙ

КИСЛОТЫ

Н2- СП -ИП- СН ОН (У) 1

Изобретение относится к способам модификации нуклеиновых кислот, в частности к способу модификации,дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), -который может найти применение при структурном анализе нуклеиновых кислот и в медицине, в частности при изготовлении вакцин.

Известны способы химической модификации ДНК, например, путем обработки ее раствором дифениламина в муравьиной кислоте, которые приводят к одновременному удалению пуриновых оснований из молекулы ДНК 11) .

Однако в литературе не описаны способы, которые приводят к селективному .отщеплению от ДНК аденина, что важно при структурном анализе нуклеиновых кислот.

Целью изобретения является получение препаратов ДНК с заданным содержанием в ней аденина.

Цель достигается тем, что ДНК инкубируют с соединением обшей формулы где R„— СООН, ОН, Н;

R < — H, CH> (СН )„, где n — 0-5, при рй — 4-6 и температуре 30-50 С в течение времени, которое определяют по константе скорости реакции: к ° 104 1ОО

g 100 Х (1) где t — время от начала инкуб ации, мин;

Х вЂ” количество отщепившегося аденина, В;

К вЂ” константа скорости реакции, значение которой определяется монометилольным производным амина, используемого для дезаденимиэации ДНК, значением рН и температурой процесса.

Предлагаемый способ модификации

ДНК, который приводит к получению препаратов ДНК с заданным содержанием аденина в ней, заключается в том, что ДНК инкубируют с соединением формулы 1 при рН 4-6 и темпео ратуре 30-50 С в течение времени, которое определяют по константе скорости реакции.

Реакцию модификации предпочтительно проводят следующим образом.

732276 реакции формальдегида с амином рН реакционной смеси был ранен 4-6, Молярная концентрация амина в реакционной смеси превышает молярную концентрацию формальдегида в 3 раза, что обеспечивает полное связывание альдегида амином с образованием моном тилольного производного амина в концентрации, равной исходной концентрации добавленного к раствору формальдегида.

Для анализа препаратов ДНК, полученных при обработке монометилольными производными глицина, Р -аланина или этаноламина, используют метод ионообменной хроматографии на

ДЭАЭ-целлюлозе в сочетании с хроматографией на бумаге.

Термоденатуриронанную ДНК в концентрации 2,5 мг/мл инкубируют в течение 3 суток, 1,2,3,6 недель в

0,1 М натрийфосфатном буфере с 0,4 М монометилольным производным глицина, -аланина или этаноламина при 30, 36 или 50 С и при рН 4,0; 5,5 или

6,0. Полученный препарат (1 мл) наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (3 l 00 cM ) и элюируют О, 01 М натрийфосфатным буфером. В элюате присутствует только аденин. Кроме него определяемые количества других оснований не обнаруживаются. За появлением аденина следят спектрофотометрически.

Спектрофотометрические характеристики вещества, снимаемого с ДЭАЭ-целлюлозой 0,1 М натрийфосфатным буфером (рН 6,8) при хроматографии ДНК, обработанной монометилольным производным глицина (NMI), приведены в табл. 1.

Т а б л и ц а 1

2go

Е

2ьо до до- после Е2во бавле- добавния ления Е

MMI MMI

Е28о Е 2 о Е2

260 2Ьо 26 о

Е

2*о

260 285 0,77 0,128 0,77 0,37 0,63 0,59

0,76 О, 25 0,76 0,37 0,57 0,60

Результаты, полученные в + 1

Литературные данные для опыте. аденина и этих условиях, Связаншуюся с ДЭАЭ-целлюлозой ДНК снимают 1 М хлоридом натрия с 7 М мочевиной, обессоливают и гидролизуют

85%-ной муравьиной кислотой (175 C

90 мин) . Гидролизат хроматографируют 60 на бумаге в кислом растнорителе Кирби (метанол: концентрированная HCK

Н О вЂ” 7:2:1) и анализируют нуклеотид нйй состан гидролизата. Результаты приведены в табл. 2-6. 65

ДНК инкубируют с соединением формулы 1, которое является продуктом взаимодействия формальдегида и амина, предпочтительно с 0,4 М растнором монометилолглицина (R ÑÎOÍ, R -Н), при рН = 4-6, предпочтительно

5,5, и температуре 30-50 С, предпочтительно 50 С.

При значениях рН меньших 4, резв ко возрастает скорость неспецифического отщепления от ДНК пуриновых оснований (1). При значениях рН, больших б, скорость отщепления аденина от ДНК под действием монометилольных проиэнодных аминов значительно уменьшаетсяя.

Увеличение температуры выше 50 С

Р вызывает ускорение процесса неспецифического отщепления цитоэина, а уменьшение температуры инкубации ниже 30 С вЂ” замедление процесса отщепо ления аденина от ДНК под действием мои ометилольных произ водных аминов .

Пример . Ниже приводятся условия, в которых происходит избирательное отщепление аденина от ДНК, вплоть до практически полного его удаления, под действием монометилольных производных глицина (-аланина и этаноламина.

Монометилольные производные амина получают при взаимодействии глицина, Р-аланина или этаноламина (х. ч. ReanaI, Венгрия) с формальдегидом. Последний готовят из фармацевтического формалина (Nerk, ФРГ) .

Концентрацию формальдегида определяют йодометрическим методом. Все растворы готовят на 0,1 N натрийфосфатном буфере с таким рН, чтобы после добавления всех компонентов и завершения

tQ

ЗО

Результаты по кинетике выщепления аденина из ДНК под действием монометилольных производных аминов поз— воляют рассчитать константу скорости этого процесса. Например, в условиях опыта, результаты которого приведены в табл. б (0,4 М монометилолглицин, рН 5,5, температура 36 C) К = 7,5

° 10 мин . Такая скорость в 1000 раз превышает скорость неспецифического

732276

Т а б л и отщепления аденина от ДНК в соответ- . ствующих опыту условиях, но в отсутствии MMI .

Данные о скорости процесса дезаденинизации ДНК под действием монометилольных производных аминов поз- воляют заранее рассчитывать время инкубации для получения препаратов

ДНК с заданным соедржанием аденина в ней по формуле (I) . Величины К для тех случаев обработки ДНК, которые приведены в примерах, представлены в табл. 2-6.

Процентное содержание оснований в молекуле ДНК после инкубации ДНК с 0,4 M монометилолзтаноламином в 0,1 М натрийфосфатном буфере при о рН 4, О и температуре 36 С дано в табл. 2.

-Таблица 5

Таблица е3 суток 10,6

1 неделя 3, 6

63 3 суток 20,0 31,5 24,5 24,0 29

89

1 неделя 13,5 34,2 26,4 25,9 53

3 недели 29 41,6 30,0 25,5 90

37,4 23,9 28,1

39,8 24,2 32,4

Процентное содержание оснований .в молекуле ДНК после инкубапчи ДНК. с О, 4 М монометилол-P-аланином в

0,1 М натрийфосфатном буфере при рН 4,0 и температуре 30 С дано в табл. 3 °

-Т а б л и ц а 3 О Исходная

ДНК

28,8

19, 2

11,5

3,2

2,9

28,6 21,2

21,4 Q

23,9 46

25,9 68

27,7 87

28,2 96

22,6

25,8

34,3

36,8

21,8 31,6 22,4 24,2 28

14,5 34,3 . 24,4 26,8 49

10,5 36у 3 23,7 29,5 64

55 3

43,0 27,1

41,2 27,7

П р и и е ч а н и е: К = 7,0.

Процентное содержание оснований в молекуле ДНК после инкубации ДНК с 0,4 M мономстилолглицином в 0,1 M натрийфосфатном буфере при рН 5,5 о и температуре 50 C дано в табл. 4.

П р и м е ч а н и е : К = 1,0 суток .14,4 34,4 26,0 25 2 50 еделя 5, 0 40

П р и м е ч а и и е : К 1,3.

Процентное содержание оснований в молекуле ДНК после инкубации ДНК с 0,4 М монометилолглицином в 0,1 М натрийфосфатном буфере при рН 6,0 и температуре 50 С дано в табл. 5.

35 П р и м е ч а н и е: К 2,9.

Процентное содержание оснований в молекуле ДНК после инкубации ДНК с 0,4 М монометилолглицином в 0,1 М натрийфосфатном буфере при рН 5,5

4О и температуре 36 С дано в табл. 6.

Таблица

Примечание:К=4,15.

Формула изобретения

1. Способ модификации дезоксирибонуклеиновой кислоты, о т л и ч а ю ш и и с я тем, что, с целью получе732276

Составитель A. Бочаров

Редактор 3 . Бородкина Техред Н. БабуркЪ Корректор В. Бутяга

Тираж 495 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 1649/16

Филиал ППП Патеит, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 ния препаратов дезоксирибонуклеиновой кислоты с заданным содержанием аденина в ней, дезоксирибонуклеиновую кислоту инкубируют с.соединением общей формулы

R -СН-МН-СН ОН

2 2 у

К1 где R СООН, ОН, Н;

R — Н, СНэ (СН )„, где л = 0-5, при рй 4-6 и температуре 30-50 С в течение времени, которое определяют по константе скорости реакции

К. 10 Есз

100 где t — время от начала инкубации, мин;

Х вЂ” количество отщепившегося аденина, %;

К вЂ” константа скорости реакции.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве исходного реагента используют соединение Формулы 1, где R — СООН, R — Н.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Кочетков Н.К., Будовский 3..И,, Свердлов Е.Д., Симукова Н.A. Турчинский М.Ф., Шибаев В.Н. Органическая химия нуклеиновых кислот. М., Химия, 1970, с. 500-503 (прототип) .