Способ получения рекомбинантного штамма s-формы патогенных эшерихий

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СО1.1ИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

И91 (П1

А1 (51)5 С 12 N 15

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АSTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ ий

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTHA (46) 30. 10. 90. Бюл. У 40 (21) 3877654/28-14 (22) 27.03. 85 (71) I-й Ленинградский медицинск институт им. акад. И.П,Павлова (72} В.В.Тец (53) 575 (088.8) (56) Борисов Л.Б. Энтеропатогенные кишечные палочки и их фаги. - Л,: .Медицина, 1976, (34)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМВННАНТНОГО ШТАММА S-ФОРМЫ ПАТОГЕННЫХ

ЭШЕРИХИЙ с помощью высева культуры . на селективную среду, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью получения штаммов с заданными свойствами, культуру-реципиент предварительно обрабатывают 0,85-0,907-ным раствором хлорида натрия, добавляют бактериофаг Р1 в количестве 1,0-2,0

° 10 на 1,0-2,0 ° 10 микробных клеток, s S экспозицию с фагом проводят в течение 40-45 мин при 36,6-37,2 С, а затем 120-130 мин при 18†- 22 С.

f 1.2

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии. Предлагаемый способ может быть использован

53141 2 хлорида и вновь огаждают при таком же режиме пектрифугиронания. Процедуру отмынки повторяют 3-5 раэ. Из обработанных таким образом бактерий готовят взвесь, содержащую 1,0

2 0 t0 живых клеток н 1 мл. К 1,0 мл такой взвеси добавляют траксдуцируюдля получения новых генетических вариантов патогенных эшерихий с запрограммированными изменениями н геноме. Такие штаммы необходимы для отбора продуцентов вакцин, а также для изучения мол кулярно-генетических основ регуляции вирулентности, актигекнОй изменчивости и уточнения генетических карт..

Цель изобретения получение рекомбинанткых йтаммов фо м патоге".íûõ

В зшгр.:хий с заданными свойствами.

Способ осуществляют следующим образом.

Трансдуцнруюш и бактериофаг Р1 выращивают на культуре-доноре. Для этого 2,5 мл 0,7%-ного аминопептидкого агара при 45-46 С смешивают с

2,0-3,0.10 бактерий и 1,0-2,0 ° 10

8 щаговых частиц, выливают на чашки с застывшим 1,5-2,0Х-ным аминопептидкым агаром и смесь выращивают

15-20 ч при 36,6-37,2 С, после чего смывают 0,7Х-ный агар, добавив 1,02,0 мл амикопептидкого бульона. К полученной смеси добавляют 0,3

0 5 мл хлороформа, встряхивают 30

40 с и разделяют центрифугированием при 2000,0-3000 0 об/мин 20-30 мин.

Отбирают кадосадочную жидкость, которат. представляет собой лизат фа,га Р1. щттй бактеркофаг в концентрации 1,02,0 10 (0,1 мл), после чего смесь инкубируют прк 36,6-37,2 С н водяной бане в течение 40-45 мин а затем при

18-22 С вЂ” 120-!30 мин. Смесь центрифугируют при 2500-3000 об/мин

20-30 мин при 18-22 С для осаждения бактерий. Надосадочную жидкость, содержащую неадсорбиронанные фаговые частицы, сливают. Осадок ресуспендируют н 0,3-0,4 мл раствора хлорида натрия и засевают по 0,15-0,2 мл на чашки с селектинной средой. Тра.-.— сдуктакты выращивают н течение 48-

50 ч. Отбирают колонии, соответствующие S-формам бактерий.

Пример 1. Передача гена от культуры IM12Tnt0.

1О

I5

В случае получения умеренного варианта фага Р1 (P.1 cml, clr 100) культуру-донор выращивают при 3032 С н аминогептидном бульоне до концентрации бактериальных клеток

2,0-2,5 10 в мл. Индуцируют фаг, инкубируя бактериальную культуру

35-10 мин прн 40-41 С и 60-65 мик при 36,6-37,2 С.Затем к бульону добавляют 1/ t0 объема хлороформа и смесь встряхивают 30-40 с. Фаголи- . зат отделяют центрифугированием при

2000-3000 об/мин 20-30 мин.

Для осуществления трансдукции бактериальную культуру-реципиент вы ращивают в аминопептидном бульоне в течение 15-17 ч, разводят 0,85

0,907-ным раствором хлорида натрия в 3-5 раз и осаждают центрифугированием при 2500-3000 об/мик в течение 30-35 мин при t8-22 С. Надосадочную жидкость сливают, осадок ресус. ендируют в прежнем объеме раствором ла собой лизат фага Р1.

Культура-реципиент зшерихии 0,124 в S-форме — нирулентный штамм чт 1240.

Выращенные н аминопептидном бульоне в течение 15 — 17 ч бактерии развели 3 раза 0,85Х-ным раст-, вором хлорида натрия и осадили центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин при 20 С. Надосадочную жидкость слили, осадок ресуспендировали в прежнем объеме

1 раствора хлорида натрия к снова осадили. Процедуру повторили. 4 раза.

55 После четвертого осаждения из бактерий была приготовлена взвесь, со держащая 1,0 ° 10 клеток i 1 мл. К

1,0 мл такой взвеси добавили 1,0 10 т

Исходный фаг в количестве 1,0 10 гмешали с. 2,0 10 клеток-донорон, добавили 2,5 мл 0,77-ного аминопеп4 тидного агара при 45 С и после смешивания вылили на чашку с 1,57 аминопептидкым агаром. Смесь ныращивали

17 ч при 37 С, после чего 0,7Х-кый, агар был смыт при добавлении 2,0 мл

З5 аминопептидкого бульона. К полученной смеси добавили 0 5 мл хлороформа, смесь встряхивали 40 с к затем разделяли центрифугированием при

3000 об/мин 20 мин. Отобрали надоса. дочкув жидкость, которая представляПредлагаемый способ позволяет впервые получить рекомбинаты патогенных эшеризий, находящихся в Sформе, прн трансдукции фагом Pl

Составитель Н.Кузенкова

Редактор Л.Лашкова Техред В.Кадар Корректор .С.Черни

Заказ 4353 Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 1253 трансдуцнрующего бактериофага (бактериофаг был предварительно оттирован по методу Градна на индикаторной культуре QD 500). После добавления бактериофага смесь инкубировали при

37,0 С в водяной бане 45 мин, а затем 120 мин при 20 С. После инкубации смесь центрифугировали для осаждения бактерий при 3000 об/мнн в течение 30 мин при 20 С. Надоса- 10 дочную жидкость, содержащую неад-. сорбированные фаговые частицы, слили и осадок ресуспендировали в 0,3 мл раствора хлорида натрия. Затем полученную взвесь высеяли на.две чашки с аминопептидной средой, содержащей тетрациклин 15 мкг/мл. Чашки инкубнровали 48 ч при 32 С. Среди колоний, выросших на чашках, отбирали только соответствующие S-формам. Zo

Для отбора tif 1 вариантов (tif 1 соответствует гену rec А 441) отобранные колонии рассевались на амннопептидной среде, содержащей тетра.циклин 15 мкг/мл и выращивались 48 ч 25 при 32 С. Полученные после этого колонии проверялись на способность к росту мннимальной среде М9 с миннмальным. агаром 1,5X (Difco}. Для этого стерильными спичками каждая

141 4 испытуемая колония пересевалась на две чашки с этой средой. Чашки выращивались: одна при 32 С, другая при 42"С (известно, что tif 1 варианты не способны расти при 42 С).

Через 48 и инкубации отобрали колонии, давшие рост при 32 С и не давшие при 42 С. Они соответствовали рекомбинатам с желаемыми свойствами tlf 1 тп10, Для отбора трансдуктантов в проведенных экспериментах были использованы следующих их свойства: трансдуктанты, содержащие гены, кодирующне устойчивость к тетрациклину (тп10), растут на аминопептидном агаре, содержащем 10-15 мкг/мл соответствующего антибиотика, трансдуктанты, приобретшие. ген rec А 56, идентифицируются по возрастанию в 1000

10000 раз чувствительности к УФ-облучению, трансдуктанты, получившие ген tif 1, теряют способность .расти на минимальной среде М9 при 42 С и растут прн 32 С.