Рекомбинантная днк и способ ее получения

 

1. Рекомбинантная ДНК М131СЬП2, содержащая полинуклсотиды, кодирующие последовательно аминокислотные остатки 1-158 с/,, интерферона человека и остатки 8-146 р-галактозидады Е. coli, трансляционно слитые под контролем промоторов piac, р5Г02 1981, 16,63. , gem. 1983, J. Beet, 1984, и сайта связывания рибосом SD, с возможностью продукции в трансформированных ею бактериях Е. со Li Ml 03 гиРридного белка, проявляющего интерферонсподобное антивирусное действие и ферментативную активност1. 2. Способ получения рекомбинантной ДНК X13iGhll2 путем слияния полинуклеотида, кодирующего аминокислотные остатки 8-146 -галактозидады, и гена интерферона, клонированного в составе векторной ДНК фага М13тр8, отличающийся тем, что, с целью обеспечения единой непрерывной фазы трансляции спитиъгх генов, из ДНК M13mp8SP02N2 удаляют полинуклеотидную последовательность, содержащую сигнал прекращения трансляции TAG - гена интерферона ;У, путем ферментативного расщепления ДНК М13трВ SP2N2 по сайтам PSt1 и последующей лигазной сщивки концов ДНК с помои(ью ДНК-лигазы Т4 с образованием циклической кольцевой ДНК М13 IGhl12. $ (Л to ел о ел ел

СО!ОЗ СОВЕТСНИХ

СО! !ИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

А1

„„SU„„1250575 чФ

tg) 4 С 12 N 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ЙИ Л;.г::.

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬ1ТИЙ (21) 3779168/28-14 (22) !0.08.84 (46) 15.08.86. Бюл. М - 30 (71) Всесоюзный научно-исследонатепьский институт молекулярной биологии (72) В.A.Ïåòðåíêo, С,И.Татьков, Л.Н.Семенова и А.A.Èëüè÷åâ (53) 616.07(088.8) (56) Wetrel et 1, pem. 1981, 16,63.

Croysselu А. et. al. 8em. 1983, 17, 279.

M.G.Cosadeba et a1. J. Beet, 1980, 143, 971, St. N.Cohen et. а1. gem. 1984, 29, 263-269. (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ДНК И СПОСОБ ЕЕ

ПОЛУЧЕНИЯ (57) 1. Рекомбинантная jIHK M13IGhl12, содержащая полинуклеотиды, кодирующие последовательно аминокислотные остатки 1-158 d,, интерферона человека и остатки 8-146 !1-галактозидады

Е. coli, трансляционно слить|е под контролем промоторов plac, pSP02 и сайта связывания рибосом SD, с возможностью продукции н трансформирснанных ею бактериях Е. coli M!03 гибридного белка, проянляющего интерферонсподобное антивирусное дейстние и ферментатинную активность.

2. Способ поучения рекомбинантнсй ДНК М13.гО!1112 путем слияния полинуклеотида, кодируют его аминокислотные остатки 8-146 р -галактоэидадь, и гена интерферона, клонирован— ного в составе векторной ДНК фага

М13тр8, отличающийся тем, что, с целью обеспечения единой непрерынной фазы трансляции слитнъгх генов, из ДНК М13гпр88РО2112 удаляют полинуклеотидную последонательность, содержащую сигнал прекращения трансляции ТАС вЂ” гена интерферона,рпутем ферментатинного расщепления ДНК

М13mp8 SP2N2 по сайтам PSt1 и последующей лигазной сшинки концов ДНК с помощью ДНК-лигазы Т4 с образованием циклической кольцевой ДНК М13

IGh112.

12 0575

Изобретение относится к медицине, а именно к молекулярной биологии и генной инженерии.

Це1гью изобретения является обеспечение единой непрерывной фазы трансляции слитных генов эа счет того, что направленно исключают из ДНК

М!3mp 8SP02N2 полинуклеотидиую последовательность, содержащую сигнал прекращения трансггяции ТАС геггл,. т иитерферонл и обеспечивают совпадение фазы транспяции генов — интерфероил и;(-пептидл Г -галлктозидазы, Рекомбииантиая ЛНК М13 IGhll2 спдержит полииуклеотидьг, кодирующие последовательно лминокислотные остатки 1 †1 l, ииTåðôåðñHл челоsåêa и ocтлтки 8-146 P — глллктозидлчы

Е. со1г, трансляционно слитые под контролем промоторон plac., pSP02 и слйта связывания рибосом 60.

Гпособ осуществ-гяют следующим образом.

Днухпепочечную кольцевую форму

ДНК М!3тр 88Р02Я2 подвергают гидролизу с помощью зндонуклеазы PstI..

Последняя расщепляет ДНК по сайтлм

PstI, в результате чего образуются днл фрлгмеитл ДНК, резко отличающиеся по молекулярному весу. Смесь обблрлбывлют ДНК-лиглзой фага Т4, которая обеспечивает ковллентное сордииеиие концов линейной ДНК и образование гГиклической двухцепочечной

UJK. Лля отделения ЛНК, которая при обрлботкг-. лиглзой лхвлтила малый

Pst-Pst фрагмент, смесь обрабатывают рестриктлзой 8а1 GT. Полученным препаратом трансфипируют бактерии

Е. со! i,,1103 обычггым способом и от- 4О бирлют к.чоиы блктерий, которые способны образовывать колонии на тнердом лглре, окрлгггггвлемые н голубой или синий цвет в присутствии хромофориого субстрлтл P — гллактоэидаэы

5-бром-иггдоксил-3-р,-D галактопираиозидл (Y-Гл!). Клоны инфицированных бактерий размножают, отделяют обычным способом бактериофаг и выделяют из него одноцепочечиую кольцевую 50

ДНК, 1НК анализируют с помощью электрофорезл н агарозе и отбирают препараты, поднижность которых в геле не отличается заметно от подвижности исходной 11НК М!3mp HSP02N2. Из бак- 55 терий F. cnli,1М103, трансформированных этими препаратами ДНК, выделяют двухцепочечную кольцевую ДНК. г.труктуру ДНК, н которой отсутствует полинуклеотиднля последовательность, содержлшая сигггал прекрлггГеггия трлисляции ТАГ геил иитерферонл g

2 доказывают методами рестрикциоиного лиллизл. Так, при гидролизе полученной ЛНК рестриктазами PstI u FcnRJ получлн1т фрагменты ЛНК, соответствующие длине 284 и 498 плр нуклеотидон, обилруживлемые при электрофорезе в

67-ном полиакриллмидном геле и идентифицированные гго длиие в сраниеиии с этллоиггым Вар? — гидролизатом ДНК рВК327. Рестриктазл EcoRJ гидролизует ДНК с обрлзонлггием фрагмента длиной 284 пары нуклеотидов, В отличие от исходной ЛНК 1!13mp 88РО2Х2 н полугеииой ЛНК 113 1ГЬ112 отсутствует участок, включающий сайт узнавания рестриктазы Sal GT., ггл что указывает устойчивость ДНК к действию этой регтриктазы. О том, что 11НК М13

IGh112 -.näåðæèò трлггсляггиогггго слитные гены Г -интерфероиа иЫ -пептида р --галлктозидазы, свидетельстнуют также данные биохимического анализа продукта экспрессии этих генов н бактериях-гибридного белка, обеспечиваюгггегo фермеитатинную активность ! -галактозидлэы.

Пример. Днухцепочечиую кольцевую ЛНК 113mp 8SP02N2 выделяют из штамма бактерий Eschcrichia coli

1m 103, трлнсформироваиных этой ЛНК, и очищлют центрифугированием н градиеите плотности хлористого цезия.

Гоответствие ДНК приписываемой структуре подтверждают анализом продуктон фермеитатинного гидролиза ДНК рестриктазами Есор?, PstI u Sal GI, Продукты гидролиза, фрагменты ДНК различной протяженности, идентифицируют по их подвижггости в 67,-иом полиакриламидиом геле в сравнении с зтаггоинымгг фрагментами BspI — гидролизатл плазмиды pBR 327 Наблюдают образование фрагментов длиной около 300 и 500 пар иуклеотидон (п.н.), что соотнетств>ет следующей ожидаемой схеме гилролиза: FcoRJ

284 гг ° н,; ЕсоК1+Рнt 1 — 36 п.и, Jие прокрашивается), 284 п.н., 498 п.и., ЕcoRI+ Sal GI 284 п.и., 523 п,н, Слияние генов интерфероиа и ы -пептида Р, -галактоэидлзы осуществляют следующим образом, Очищенную и охарактеризованную ДНК M13mp 8SP02N2 (2г! мкг) обрабатынлют рестрикта1251!. -) 4 влиигм о-нитрофени.т-гяллктозидл. Для, 7 и 2с(клонов трлнгформир<1влнньгх б.тктерий наблюдав т высокий уровень л к т ит ногти,R — г ал л к т о 3 ил л 3 и (1, 1— ., 1 сдlмт1) . 1Итоковые рлгтвор11 флгов (и 1 50 мк.t ) из клс нс ri, демонстрируf гЩИХ rtl ICОКИй УPOftnttf 1<-ГЛЛЛКтС ЗИДЛЗно< активно гти лги<сит з л<1т дгlя инфи:.ировлния блктерии E. гn l i .IC103 (ио 500 мкл но<1ной культуры) . 11ncëå ин1ицировлния пробы рлзблвтт<тют 40 мл гр ды УТ, доблвгтяют И ТГ до ко1гцен т рл<пти 10 M и инку бируют при клчл< нии 5,5 ч при 35 Г, Клетки осаждают центрифугировлнием, разрушают путем

11огледснательной обработки лизоцимом ъ-п.трлзвуком и определяют в лизатлх лнтивиругную интерфероноподобную лктивность извес тнь;.1 гпособо« Одноt ре«с нтнт в клетклх и их лизлтах опрегтгл1<ют ферментативную лктивность13—

I,л.;,зктс идлзы. Отбирают клон, названи

<ЫИ Кдои 12, дЕМОНСтрИруЮШИй СаМЫй

1<11<.окий уровень лнтивирусной активног и (407 от контрольного штамма

Г. cnl i Л(1103, трангформировлгц<ого рекомбинлнтной ДНК,113п1р 8БР02N2) и ферментлтивной лктивнссти. Из бак",с рилл1 ной мл гсы этого клоня вь(<теля«т;тт<чхце<точечную ко tr цевую !(НК, назвл11нуv <113 Т01т112, структуру котоР 1 . П< Дт ВЕРжДЛЮт ДЛННЫЕ ЛНЛ<1н3 <т ПРОду;т<тн ге гидролизя рестриктлэлми

ЕсоКТ, P3t I и S<31 (I.Выделяют тлкже

11.1 блктс риофаг а ogttotterroitcitftyfr ДНК, 35 котор л хлрлктеризук т по электр< фор тичегкой подвижности в геле аглро<ы при сравнении с контро If>HI IIIII обр,1! tt тми IHK различной длинь (113mpI, М13ш11 88Р02И2) . ПРи гидРолитс двУх

40 цепс чс чной IHV Ml 3 Т< 11112 получают гстс дую<1(ие фрагменты, идентифицировлнны<. гн подвижности в 6 --ном полизой Pstl (200 ед.) до полного гидролизл ДНК, контролируемого с помощью электрофрезя в 17,-ном лгарозе.

Белок отделяют фенольной зкстракцией и осаждают ЛНК зтлнолом, Отделенную 11НК подвергая т лttt 113ftot сшивке с помоп(ью 1НК-лиглз1 34 при 10 С в течение 17 ч, после чего смегь прогрео влют 15 мин при 65 Г и обрлблтывают рестриктазой Баl (.I. Погле инлктивации фермента прогреванием при 65 С в течение 15 мин пробу анллизируют злектрофорезом в 17.-ном лглроэе и убеждаются в том, что линейная двухцепочечная ДНК преврлтичась в кольцЕВуЮ ДНК, НЕ От<тИЧЛЮП(уЮГя По 1 Одвижногти при злгктрофор< зе ст ДНК

M13mp 8SP02N2 или других проитнодных ДНК флга 113 бпизкого рл.м< рл.

Г1оттученным препаратом П1К < 50 мкл трлнгфицируют предвлрительно обрлбота11ные хлоригтым клгп,t(IIE t . клетки

E. c о l! ХМ103 и выгс 1 лют их нл твердый агар, содерж.лщий иидуктор — галактозидазы изопрописттис-; -11-глчактопирлнозид (ИIIТ! и хромофорньп< у субстрат Г1 -глттактозидлзь| 5-бром— индокгил-3-Я-D-глллктопиранозитт (Y-Gal), lInc <с иик бяции чашек с 1 агаром при 37 Г в течение 16 ч наблюдают образовлние на них 29 негативньгх колоний, окрлшенных в бледно-синий цвет. В контрольном эксперименте при трлнсекции бактерий исходной ДНК MI3mp 8SP02N2 образуются неокрашенные негативные колонии. Все полученные колонии переносят петлей в конические пробирки, содержащие по 1 ьсп питателт,ной среды т Т, и инкубируют гмеси при 37 (: при помешивании, Через 7 ч в каждую пробирку вносят по 5 мкл 100 м ИПТГ и оставляют их при 37 С на ночь. Клетки осаждают центрифугированием, суперна:анты переносят в чистые пробирки, 4> добавляют в каждую из них по капле хлороформа, закупоривают и оставляют храниться 11ри 8 С, игполь 1уя в качестве ILToKortorо раствора бактериофлгл для инфицирс вания, Осадок клеток в каждой пробирке ресуспендируют в 1 мл буферно1 о раствopa 7 и определяют акт<ииfость, — галак ToзHgàзы общепринятым методом с использоТираж 490 Подписное г. Ужгород, ул. Проектная, 4

ВНИИПИ Заказ 4377/21

Произв.-полигр. rip-тие, ль t и

8SP02N2 получеш п< препарат отлича<- с я ус тойчивог 1 ьк1 к дг<игтнию р< гтриктлзы Sa1 GI, что ук<тзь<влет нл отсу;ствие в ней последовлтельногти (С(ЛС, включая>щей часть гиг нллл

1 рс.крашения трансляции ТЛГ.