Ферментный электрод для определения концентрации тиохолиновых эфиров

 

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использввано для определения субстратов холинэстераз. С целью повышения чувствительности и селективности определения токосъемник выполняют из амальгамированного серебра. Мембрана выполнена из нитрата целлюлозы, в которую введена холинэстераза и - глутаровый альдегид в количестве 10,6-12,6 и 17,5-18,0 мас. соответственно . Это позволяет определять субстрат в количестве I 10 м/л в присутствии тиохолиновых зфиров. 1 ил.,2 табл. а (Л :о о со

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11>

А1 (511 4 С1 И 27/30

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

00 делАМ изоБ ктений и QTHpblTHA

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ц, Н ASTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3749229/31-25 (22) 19.03.84 (46) 15.03.87. Бюл. У 10 (71) Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина (72) Г,К. Будников, Э.П. Медянцева, Н,А. Улахович и С.С. Бабкина (53) 543.257 (088.8) (56) Матерова E,À., Никольская Е.Б.

Ионоселективные электроды в исследовании холинзстераз. — Успехи химии, 1980, т. 69, вып. 10, с. 19371944.

Будников Г.К. и др. Электрохимия хелатов металлов в неводных средах.

М.: Наука, 1980, с. 24, (54) ФЕРМЕНТНЫЙ ЭЛЕКТРОД ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ТИОХОЛИНОВЫХ

ЭФИРОВ (57) Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для определения субстратов холинэстераз. С целью повышения чувствительности и селективности определения токосъемник выполняют иэ амальгамированного серебра. Мембрана выполнена из нитрата целлюлозы, в которую введена холинэстераза иглутаровый альдегид в количестве

10,6-12,6 и 17,5-18,0 мас ° 7g соответственно. Это позволяет определять субстрат в количестве 1 ° 10 м/л в присутствии тиохолиновых эфиров.

1 ил.,2 табл.

1? 96913

Изобретение относится к электрохимическим устройствам, ис".îëüçóåмым в аналитической химии для опре-, деления соответствующих субстратов, ингибиторов, активаторов холинэстераз, а также может быть использовано в энзимологии для определения скоростей ферментативных реакций.

Цель изобретения — увеличение чувствительности и селективности определений.

Отклик ферментного электрода на концентрацию субстратов холинэстераз наблюдается практически мгно4 венно.

Определение субстратов и ингибиторов ХЭ основано на электрохимичес-кой активности одного из продуктов гидролиза субстрата, специфичного к ХЭ вЂ” бутирилтиохолин иодида (БТХИ), С Н COSCH CH N СН ) J + Н О--—

С Н СООН + НБСН - (СН )з J

Продукт гидролиза БТХИ вЂ” тиол способен образовывать меркаптид ртути, 2$ который восстанавливается на ртутном капельном и амальгамированном серебряном электродах.

На вольтамперограммах БТХИ на стационарном амальгамированном сереб- 30 ряном электроде наблюдается небольшой,пик при потенциале -0,55 В относительно насыщенного каломельного электрода, который быстро растет в присутствии ХЭ, Высота пика зависит от концентрации как субстрата и ингибиторов ХЭ, так и ее активности и концентраций. Ферментный электрод и электрод сравнения погружают в анализируемый раствор, содержащий буферный боратный раствор с рН 8,28 4, Раствор термостатируют при 25 о или 37 С, продувают током водорода или аргона и снимают вольтамперограммы в интервале потенциалов 45 (-О, 1) -(-О, 8) В. Минимальный объем анализируемого раствора 4-5 мл, На чертеже изображен предлагаемый электрод.

Электрод состоит из стеклянного или фторопластового корпуса амальгамированного серебряного электрода

1, в который вставлена серебряная . проволока 2, спаянная с медной 3,. гофрированной пленки 4 из нитрата целлюлозы с включенной в нее ХЭ и прижимных колец 5.

Серебряную проволоку диаметром

О 5 мм закрепляют и стеклянной труб9 ке или фторопластовом стержне с помощью эпоксидной смолы ЭПД или механически. Затем поверхность электрода шлифуют до зеркального блеска и опускают в металлическую ртуть на

2 мин и излишки ртути стряхивают.

Для получения иммобилизованной

ХЭ 0,1 r нитрата целлюлозы растворяют в смеси органических растворителей толуола и бутилацетата (1:1,6), добавляют 0,,2 мл водного раствора ХЭ (навеска 0,0180 г) и после перемешивания — гексан в качестве коагулянта. Для более прочного связывания фермента с матрицей перед добавлением гексана приливают 0,1 мл 25%-ного раствора глутарового альдегида. Из этой смеси на стеклянной поверхности получают пленку, из которой выре" зают кусочки размером 25 б5 мм, Пленку закрепляют на поверхности корпуса электрода с помощью прижимных колец или других зажимов, для увеличения рабочей поверхности пленку используют в гофрированном виде, Определения с предлагаемым фер— ментным электродом осуществляют следующим образом, П р и и е р 1. Построение градуировочного графика для определения

БТХИ.

В мерную колбу на 5 мл вводят

0,05-3,00 мл стандартного раствора

БТХИ с концентрациеи 0,005 г/мл, доводят до метки боратным буферным раствором с рН 8,4. Переносят раствор в электролитическую ячейку с насыщенным каломельным электродом и ферментным электродом, удаляют кислород продуванием в течение 15 мин (время достижения равновесия реакции гидролиза должно быть постоянным во всех определениях) аргоном или электролитически генерированным водородом, Снимают вольтамперограммы в интервале потенциалов от -0,1 до 0,8 В при скорости наложения потенциала 1 В/с при непрерывном режиме поляризации с треугольной разверткой потенциала, Измеряют высоту пика при потенциале -0,55 В.

Строят градуировочную прямую, выражающую зависимость величины тока в гике от концентрации БТХИ.

Определение неизвестной концентрации субстрата.

В мерную колбу на 5 мл вносят н известное количество БТХИ, доводят з 1296913 до метки боратяым буфером с рН 8.,4, перемешивают и переносят ячейку.

Все дальнейшие операции проводят Введено как описано выше. По высоте пика С,104 при потенциале -0,55 В и градуировоч- ному графику определяют концентрацию субстрата.

В табл. 1 приведены результаты 0,30 определения БТХИ с помощью предлагаемого ферментного электрода (n = 4; 10 о 60

Р = 0,95).

Таблица 1 1,00

Sr ° 10

Найдено

С 10 г/мл, X

0,32

3,0

0,61

2,0

0,97

Таблица 2

Введено

Ф Найдено втъи > C 10 г/мл ьтхи э г/мл, Х

Sr 10 а

0,85

1,0

7,6

3,5

3,45

1,6

10, 10

10,0

1,5

Пример 2. Определение концентрации ингибитора (хлорофоса).

В медную колбу на 5 мл вводят

1 мл стандартного раствора БТХИ концентрацией 0,005 г/мл, добавляют от 0,05 до 0,20 мл стандартного раствора хлорофоса с концентрацией

0,005 г/мл, доводят боратным буферным раствором до метки, перемешивают и переносят в электролитическую ячейку с насыщенным каломельным и ферментным электродами. Удаляют кис. лород в течение 15 мин током аргона или водорода и снимают вольтамперограммы в интервале потенциалов

40 (-0,1)-(-0,8) В (скорость наложения потенциала 1 В/с, непрерывный режим поляризации, треугольная развертка потенциала). Измеряют высоту катодного пика при потенциале -0,55 В.

Строят градуировочную прямую, выражающую зависимость высоты катодного пика от концентрации ингибитора, Неизвестную концентрацию ингибитора находят по градуировочному графику.

В табл. 2 приведены некоторые результаты определения хлорофоса с помощью предлагаемого ферментного электрода (n = 4; Р= 0,95).

Предлагаемый ферментный электрод позволяет снизить нижнюю границу определяемых содержаний субстрата по сравнению с известными способами определений до 1 10 моль/л, повысить селективность определений (дает отклик в присутствии лишь тиохолиновых эфиров). С помощью предлагаемого электрода можно определять не только субстраты, но и ингибиторы холинэстераз до концентрации

1 ° 10 M (0,2 ° 10 г/мл). Электрод прост в изготовлении, его конструкция позволяет легко заменить фермент, потерявший активность на новый. путем замены пленки, содержащей иммобил .зованную ХЭ.

Время жизни мембраны составляет

1 неделю.

Формула изобретения

Ферментный электрод для определения концентрации тиохолиновьгх эфиров, включающий корпус, внутри которого расположен токосъемник, электролитически связанный с мембраной, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности и селективности определения, в качестве токосъемника использован серебряный амальгамированный электрод, а мембрана выполнена из пленки на основе нитрата целлюлозы с введенными в нее холинэстеразой и глутаровым альдегидом в следующих количествах, мас, 7.:

Холинэстераза 10 6-12,6

Глутаровый альдегид 17,5-18,0

Нитрат целлюлозы . Остальное

1296913

Составитель И. Рогаль

Редактор Н, Киштулинец Текред И.Попович Корректор Г. Решетник

Заказ 769/45 Тираж 777 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР. по делам изобретений н открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,,д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4