Способ количественного определения белковых фракций в крови животных

 

Изобретение относится к области биохимии, к выявлению белковых фракций на крахмальном геле после их разделения методом электрофореза. Целью изобретения является повьшение точности определения белка во фракциях. Способ заключается в использовании красителя - водорастворимого нигрозина для окрашивания электрофореграмм в количестве, составляющем 0,003 мае.%, а количество метанола в смеси для отмывки устанавливают равным 2-3 мас.%. Использование в качестве красителя водорастворимого нигрозина повышает точность определения белковых фракций , а также требует в два раза меньше метанола для отмывки крахмальных фореграмм. 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

COL(VIA ËÈÑÒÈ×ÅÑÍÈÕ

РЕСПУБЛИК (,51) 4 G 01 N 33/68,13, ц

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К .А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3947786/31-13 (22) 2 1.08.85 (46) 30.04.87. Бюл. № 16 (71) Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт Восточного отделения ВАСХНИЛ (72) Л.Б.Кацова и В.С.Бочекалова (53) 637.627.6 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

¹ 405071, кл. G 01 N 33/68, 1972. (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВЫХ ФРАКЦИЙ В КРОВИ ЖИВОТНЫХ (57) Изобретение относится к области биохимии, к выявлению белковых фракций на крахмальном геле после их раз„.80„„1ЗО7ЗЗ8 А1 деления методом электрофореза. Целью изобретения является повышение точности определения белка во фракциях.

Способ заключается в использовании красителя — водорастворимого нигрозина для скрашивания электрофореграмм в количестве, составляющем 0,003 мас.%, а количество метанола в смеси для отмывки устанавливают равным 2"3 мас.%.

Использование в качестве красителя водорастворимого нигрозина повышает точность определения белковых фракций, а также требует в два раза меньше метанола для отмывки крахмальных фореграмм. 3 табл.

1307338

Изобретение относится к биохимии, в частности к выявлению белковых фракций на крахмальном геле после их разделения методом электрофореза.

Цель изобретения — повышение точ- 5 ности определения белка во фракциях.

Способ заключается в том, что в качестве красителя используют водорастворимый нигрозин в количестве, составляющем 0,003 мас.7 ° Количество

10 водорастворимого нигрозина установлено опытным путем, а количество метанола в смеси для отмывки устанавливают равным 2-3 мас.l.

Способ определения белковых фракс 15 ций на крахмальном геле осуществляют следующим образом.

Пример 1, Готовят растворяющую и отмывающую смесь. Для этого берут метанола 300 мл, воды 600 мл, ледяной уксусной кислоты 100 мл. В

100 мл указанной смеси расгворяют

20 мг нигрозина водорастворимого. В краситель помещают крахмальную элект25 рофореграмму сыворотки кролика на

20 мин, после чего указанную фореграмму выдерживают по 60-90 мин в трех последовательных порциях приготовленной отмывающей смеси. Аналогичную (параллельную) электрофореграмму

30 окрашивают амидочерным 10Б и отмывают в смеси метанол-вода-ледяная уксусная кислота в соотношении 5:5:1, так как краситель амидочерный 10Б требует большого количества метанола.

Результаты количественного определения содержания белковых фракций сыворотки крови кролика на крахмальных фореграммах (одна фореграмма ок40 рашена амидочерным 10Б, вторая — нигрозином, водорастворимым), промытые указанными отмывающими смесями, приведены в табл.1, Пример 2. В качестве раство- 45 ряющей и отмывающей смеси применяют следующий состав: метилового спирта

200 мл, воды 650 мл, уксусной кислоты 150 мл. Для красителя берут 30 мг водорастворимого нигрозина в 100 мл смеси. В указанный краситель помещают электрофореграмму сыворотки крови бычка У 1 на крахмальном геле на

25 мин с последующим отмыванием красителя в указанной смеси в течение трех раз по 60-90 мин.

Параллельную электрофореграмму окрашивают амидочерным 10Б анапогич— но примеру 1.

Количественное содержание белковых фракций сыворотки крови бычка г 1, окрашенных амидочерным JOB и водорастворимым нигрозином, по данным электрофореза в крахмальном геле представлено в табл.2.

Пример 3. Для приготовления красителя берут 25 мг водорастворимого нигрозина на 100 мл смеси следующего состава: метанола 250 мл, воды

625 мл, ледяной уксусной кислоты

125 мл, Окрашивают и отмывают электрофореграмму сыворотки крови бычка

Ф 2 на крахмальном геле аналогично примеру 1. Параллельная электрофореграмма того же бычка окрашена амидочерным 10Б.

Результаты количественного определения белковых фракций сыворотки крови бычка Ф 2 представлены в табл,3

Как видно из полученных примеров табл.1-3, краситель нигрозин водорастворимый адсорбируется равномерно всеми сывороточными белками. Особенно четко это видно в альбуминовой фракции всех животных. Количество связанного этой фракцией нигрозина водорастворимого пропорционально количеству белка на крахмальной фореграмме, Краска избирательно окрашивает белковые вещества. Допускаем слабое окрашивание крахмального геля, которое не мешает ясности границ раздела между фракциями белка на крахмальной фореграмме. Указанная отмывающая смесь обеспечивает хорошее отмывание красителя, четкость окраски и экономит расход метанола почти в два раза.

Таким образом, предлагаемый способ повышает точность определения белковых фракций, так как краска избирательно окрашивает их, слабо окрашивается крахмальный гель и ясно выделяются границы раздела между фракциями белка на крахмальной фореграмме. Использование предлагаемого способа в практике способствует точности определения белка в каждой фракции и экономит метанол — дорогостоящий и дефицитный материал (так как на 100 фореграмм расходуется метанола на 20 л меньше).

Формула изобретения

Способ количественного определения белковых фракций в крови животных, 1307338 учетом результатов, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью повышения точности определения, в качестве красителя используют водорастворимый нигрозин в количестве, составляющем

0,003 мас.%, а количество метанола в смеси для отмывки устанавливают равным 2-3 мас.%, Таблица 1

Окраска амидочерным 10Б

Белковые фрак ции

Окраска нигрозином водорастворимым

Показа- Отн,%

Показатели Отн.%

ФЭКа г% г% тели

ФЭКа

0,40

29,5

1,90

0,50

34,1

2,20

Альбумины

Постальбумин-1

0,24

3,7

6,1

0,39

0 05

0,09

Постальбумин-2

0,06

4,1 0,27

0,29

4,4

0,06

Постальбумин-3

0,06

0,24

3,7

0,05

0,24

0,07

3,7

Церулоплазмин 0,05

0,10

0,33

0,07

Трансферрин 0,06

4,1

0,27

0,19

0,04

2,9

Гаптоглобин-1

0,24

0,05

0,22

3,4

0,05

3,7

Гаптоглобин-2

0,05

0,22

0,33

Макроглобулины 0,07

5,1

0,18

0,43

0,04

2,7

6,6, -липопротеид

0,09

0,07

0,14

0,30

4,7

2,2

0,03

0,22

3,4

0,24

0,05

3,7

0,05

0,06

0,27

0,71

11,0

0,15

0,92

0,21

14,3

0,95

14,7

0,20

П р и м е ч а н и е. Содержание общего белка 6,47 г%. предусматривающий электрофоретическое разделение белков на крахмальном геле, окрашивание электрофореграмм, отмывку их смесью, состоящей из метанола, уксусной кислоты и воды, элюи- 5 рование связавшегося с белком красителя и определение экстинкции элюированного красителя с последующим

I р-липопротеид у -глобулин ъ -глобулин

61 у -глобулин

4,1 0,27

4,7 0,30

6,8 . 0,44

1307338

Белковые фракции

Окраска амидочерным 10Б

Окраска нигрозином водорастворимым

Показате- Отн.% ли ФЭКа

Показате- Отн.% ли ФЭКа г% г%

0,04

1,3

0,10

Предальбумин

Альбумин

0,03

1,2

0,09

0,76

26,3

0,86

32,6

2,03

2,53

Постальбумин-1

0,16

0,08

5,5

0,43

3,0

0,23

Постальбумин-2

4,5

0,11

3,8

0,29

0,12

0,35

Постальбумин-3

0,24

0,09

0,10

3,8

0,29

0,24

0,14

5 3

3,1

0,41

0,67

8,7

8,0

0,62

О, 44

6,2

0,48

О, l5

5,7

0,29

0,43

0,10

3,8

0,22

0,18

2,8

0,06

2,4

0,19

0,07

2,6

0,20

8,7

0,67

7,3

0,19

0,57

0 19

6,6

0,51

0,44

0,15 у„-глобулин ъ -глобулин л -глобулин

0 25

8,7

0,18

6,8

0,67

0,52

7,3

0 56

0,21

7,3

0,19

0,57

П р и м е ч а н и е. Содержание общего белка в сыворотке крови бычка

7,73 г%.

Таблица 3

Белковые фракции

Окраска амидочерным 10Б

Окраска нигрозином водорастворимым

Показате- Отн.% ли ФЭКа

Показате- Отн.% ли ФЭКа

r% г%

0,1

Предальбумин 0,02

Альбумин 0,42

1,2

0,02

1,3

0,11

26,0

2,1

0,48

32,8

2,65

Церулоплазмин 0 09

Трансферрин 0,25

Гаптоглобин-1 0,18

Гаптоглобин-2 0,16

Макроглобулины 0,08

g-липопротеид 0,07 р-липопротеид 0,25

i Таблица 2

1307338

Продолжение табл.3

Окраска амидочерным 10Б

Белковые фрак ции

Окраска нигрозином водорастворимым оказате- Отн. 7. гX и ФЭка

Показате- Отн. X ли ФЭка г%

0,44

0,06

3,7

0,08

0,3

Постальбумин-1

0,33

0 05

0,06

4,1

Постальбумин-2

3,1

0,25

2,0

Постальбумин-3 0,07

0,03

0,16

4,3

0 35

0,04

2,7

0,22

0,03

1,8

0,15

Церулоплазмин

0,02

ipJ

0,04

2 5

О, 11

0,2

Трансферрин

0,02

1,3

0,08

4,9

0,39

Гаптоглобин-1

2,0

4,3

0,03

0,16

0,07

0 35

Гаптоглобин-2

2,0

0,16

Макроглобулины О, 12

7,4

0,03

0,6

0,05

0,28

3,4 с(;липопротеид

0,03

1,8

0,15

0,06

4,1

0,33

0,05

3,1

0,25 р-липопротеид

0,18

12,2

0,98

0,19

0,95 у„-глобулин " -глобулин п2 м -глобулин

0,14

0,77

0,18

11,2

9,6

0,9

15,8

0,23

13,0

0,21

1,05

1,28

П р и м е ч а н и е. Содержание общего белка в сыворотке крови бычка

8,09 гЕ.

Составитель Л.борисова

Техред Л.Олейник

Корректор С.Шекмар

Редактор С.Лисина

Заказ 1625/43 Тираж 777

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открьггий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5

Подписное

Производственно †полиграфическ предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4