Штамм гибридных культивируемых клеток мыши @ @ , используемый для получения моноклональных антител к ангиотензин-превращающему ферменту легких человека

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине и экспериментальной биологии . Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток мыши, продуцирующего моноклональные антитела к ангиотензин-превращающему ферменту легких человека (АПФ). Штамм получают гибридизацией иммунных клеток селезенки мышей BALB/c с клетками миеломы X63-Ag8-653. Селекцию гибридов ведут на среде HAT и клонируют методом конечных разведений. Продуктивные клоны обозначают A-ACE-3G8. Штамм A-ACE-3G8 хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК (П) 26D. Клетки культивируют на среде RPMI с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки и 10% лошадиной при м 5% СО, . Клетки пассируют 1 раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:10. Культура суспензионная . Концентрация моноклональных антител составляет 30-40 мкг/мл культуральной жидкости и 5-6 мг/мл асцитической. Моноклональные антитела относятся к классу IgGj . Они используются для выявления АПФ на срезах тканей, культивируемых клетках, биологических жидкостях и др. методами твердофазного иммуноферментного анализа , методом обогащения и др. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

Ц

РЕСПУБЛИК (Я)4 С 12 N5 00

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

l1O ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3996727/28-13 (22) 25.12.85 (46) 23.05.87. Бюл. У 19 (71) Всесоюзный кардиологический научный центр (72) Е.Ю.Алликметс, С.M.Äàíèëîâ, И.Ю.Сахаров, Е.А.Духанина, И.Н.Трахт и В.Н.Смирнов (53) 578.085.23 (088.8) (56) Auerbach R. et.al. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 1982, 79, р. 78917895. (54) IIITAMM ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК МЫШИ MUS MUSCULUS ИСПОЛЬЗУЕМЫИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ

АНТИТЕЛ К АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕМУ

ФЕРМЕНТУ ЛЕГКИХ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине и экспериментальной биологии. Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток мьппи, продуцирующего моноклональные антитела к ангиотензин-превращающему ферменту легких человека (АПФ). Штамм

„Я0„, 1312097 А 1 получают гибридизацией иммунных клето селезенки мышей ВАЬВ/с с клетками миеломы Х63-Ag8-653. Селекцию гибридов ведут на среде НАТ и клонируют методом конечных разведений. Продуктивные клоны обозначают А-АСЕ-ÇG8.

Штамм А-АСЕ-3G8 хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК (П) 26D. Клетки культивируют на среде RPMI с добавлением 107 телячьей эмбриональной сыворотки и 103 лошадиной при 3? С н 57. СО . Клетки пассируют 1 раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:10. Культура суспензионная. Концентрация моноклональных антител составляет 30-40 мкг/мл культуральной жидкости и 5-6 мг/мл асцитической. Моноклональные антитела относятся к классу IS0ii. Они используются для выявления АПФ на срезах тканей, культивируемых клетках, биологических жидкостях и др. методами твердофазного иммуноферментного анализа, методом обогащения и др. 2 табл.

1312097

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине и экспериментальной биологии.

Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток мыши, продуцирующего моноклональные антитела к одному эпитопу ангиотенэинпреврашающего фермента легких человека (АПФ), 10

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии BALB/ñ иммуниэируют внутрибрюшинным введением 80 мкг ангиотенэин-превращающего фермента, выделенного из ткани легких человека, в 0,2 мл забуференного фосфатами физраствора (ЗФР), содержащего 30 полного адъюванта Фрейнда. Через 10 дней иммунизацию повторяют введением внутрибрюшинно 60 мкг антигена в ЗФР беэ адъюванта.

Через неделю мышам вводят 60 мкг фермента внутривенно в объеме 50мкг.

Через 3 дня после этого 15 17 клеток т селезенки иммунных мышей гибридизиру- 25 т ют с 5 10 клеток миеломы мыши

Х63-Ag8-653 в присутствии 0,7 мл раствора, содержащего 45 . (об./об.) полиэтиленгликоля (ПЭГ) мол. массы

3350 и 15 диметилсульфоксида в те- 30 чение 1 мин. После гибридизации и отмывки клеток от ПЭГ клетки высевают в 96-луночные панели — по 2 10 клеток в лунку. Для культивирования и селекции гибридов используют среду

RPMI-1640 с добавлением 10Х лошадиной и 10 телячьей эмбриональной сы-4 -т воротки, 10 М гипоксантина, 4 10 M

5 аминоптерина и 1,6.10 M тимидина.

Гибриды — продуценты клонируют 40 два раза методом конечных разведений, высевая по 1 клетке в лунку, содержащую 4 10 клеток селезенки. После второго клонирования практически 100 субклонов продуцируют антитела к ан- 45 гиотензин-превращающему ферменту.

Продуктивные клоны обозначают

А-АСЕ-ÇG8.

Штамм А-АСЕ-3G8 хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР, под номером ВСКК(П) 26D и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки. Среда для культивирования — среда RPMI с добавлением 10 телячьей эмбриональной сыворотки и 10 лошадиной, 4 мМ глютамина, 10 мМ пирувата натрия,100 мкг/мл пенициллина, 10 мкг/мл стрептомицина, аминокислот для баэальной среды. Игла, витаминов для среды Игла и 0,05 мМ меркаптоэтанола.

Культивирование штамма ведут при о

37 С в атмосфере 5Х углекислоты.

Посевная доза 10 кл/мл, клетки пассируют 1 раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:10. Культура суспенэионная.

Для выращивания гибридом в асцитной форме клетки вводят в брюшную полость мышей BALB/с, обработанных

6 пристаном, в количестве 2-5 10 клеток на мышь. Асцит образуется через

12-16 дней. На животных штамм не перевивают. К моменту депонирования он проходит 8 пассажей в культуре.

Продуктивность штамма. На 3-4 день культивирования штамма секреция моноклональных антител составляет 3040 мкг/мл культуральной жидкости и

5-6 мг/мл асцитической жидкости.

Характеристика полезного продукта.

Моноклональные антитела относятся к классу IgGj<. Они специфичны к определенному эпитопу ангиотензии-превращающего фермента.

Методы оценки специфичности моноклональных антител: твердофазный иммуноферментный анализ и тест на

" обогащение".

Контаминация штамма. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Заражение микоплазмой не выявляют при окрашивании красителями на ДНК и тимидиновой метке культуральной среды.

Криок он с ервир ов ание . 1-5. 10 клеток штамма консервируют в 1 мл телячьей эмбриональной сыворотки с добавлением 10Х диметилсульфоксида. Темо пературу снижают по 4 С в 1 мин до о. о О

4 С и по 1 С в 1 мин до -40 С.Клетки хранят в жидком азоте. Жизнеспособность после размораживания составляет 70-80Х.

Штамм А-АСŠ— 3G8 используют следующим образом.

Пример 1. Гибридные клетки помещают в пластиковый флакон площадью 25 см по 5 10 в 5 мл среды

RPNI-1640 с 10 эмбриональной телячьей сывороткой, 10 лошадиной сывороткой, 4 шМ глютамина, 10 шМ пирувата натрия, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,05 шМ меркаптоэтанола. Клетки культивируо ют 3-4 дня при 37 С в атмосфере, содержащей 5 СО . Культуральную среду

1312097

К с

1,05 штамм А-АСЕ-3G8

0,75 у

1:10

0,26

1: 100

1: 1000

0t1P собирают, центрифугируют 10 мин при О

800 q и 4 С. Полученный супернатант используют как реагент для изучения специфичности взаимодействия антител с ангиотензин-превращающим ферментом легких человека с помощью метода

ELISA.

На полистироловую 96-ячеечную панель для микротитрования сорбируют

АПФ (1 мкг на ячейку) в 50 мкл кар- 10 бонатного буфера (100 mM, рН 9,6) о при 4 С в течение ночи. После насыщения панели промывают 0,2Х-ным раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) для уменьшения неспецифи- 15 ческого связывания антител пластиком, в ячейки панели вносят 50 мкл культуральной среды штамма А-АСЕ-ÇG8.

Инкубирование ведут в течение 1 ч при о

37 С. После этого панель отмывают 20

4 раза по 100 мкл ЗФР с 0,2Х БСА и

0,05Х Твин-20 и вносят коньюгат антител кролика против иммуноглобулинов мыши, ковалентно связанных с пероксидазой. После окончания инкубации о (1 ч при 37 С) несвязавшиеся продукты реакции отмывают описанным способом, а связавшуюся пероксидазу, а значит и антитела против АПФ определяют количественно по расщеплению субстрата (Н 0 ) в присутствии хромогена-ортофенилендиамина. Положительная реакция проявляется коричневым окрашиванием и просчитывается при 490 нм. 3S

Результаты опыта по из.учению специфичности связывания иммуноглобулинов из культуральной среды штамма

А-АСЕ-3G8 с АПФ легких человека, сорбированном на пластике, представ- <0 лены в табл.1 (приведенные цифры среднее из трех определений).

Т а б л и ц а1

Продолжение табл.1 штамм 8G4, вырабатывающий 1 моноклональные ан0,09

1:10 0,07 титела против липопротеидов низкой плотности .из плазмы человека

0,2Х ный раствор БСА в ЗФР

0,08

Ф

Если вместо АПФ в ячейке сорбирован БСА, то количество иммучоглобулинов из штамма А-АСЕ-ÇG8, сорбированных на БСА и выявляемых методом

ELISA, на уровне негативного контроля.

Результаты, приведенные в табл.1, свидетельствуют о высокой специфичности моноклональных антител, вырабатываемых клетками штамма А-АСЕ-3G8 к АПФ, и показывают воэможность применения антител для выявления иммобилизованного АПФ (на срезах тканей, на культивируемых клетках и т.д.) с помощью твердофаэного иммуноферментного или радиоиммунного метода.

Пример 2. На полистироловую

96 — ячеечную панель для микротитрования сорбируют антитела кролика против иммуноглобулинов мыши (100 мкл на ячейку) концентрации 20 мкг/мл о (при 4.С, на ночь). Затем после забивки плашки 0,2Х.-ным раствором БСА в ЭФР, для уменьшения неспецифического связывания антител пластиком, сорбируют иммуноглобулины мыши из культуральной среды от клеток штамма

А-АСЕ-ÇG8, полученной как указано в примере I. После отмывки панели

0,2Х-ным раствором БСА в ЭФР от не-; связавшихся иммуноглобулинов в ячейки вносят раствор АПФ (100 мкл, концентрация фермента 7 мкл/мл). АПФ, связавшийся с моноклональным антителом, вырабатываемым штаммом А-А"E-3G8, определяют количественно в ячейках для микротитрования с помощью флуо.— ресцентного метода, используя в качестве субстрата Hip-His-Leu.

Результаты опыта по изучению специфичности взаимодействия МкАТ, вы1312097

Продолжение табл.2 рабатываемых клетками штамма А-АСЕ-ЗС8 с АЛФ в растворе, приведены в табл.2.

1:10

0,340

0,324

Таблица 2

0,27 БСА в ЗФР 1

Ф

Среднее из трех независимых опе ределений, Результаты, приведенные в.табл,2, p.) свидетельствуют о высокой специфич" ности моноклональных антител, выра15 батываемых клетками штамма A-АСЕ-3G8, по отношению к АПФ и показывают возможности применения их для выявления

АПФ в растворах (в биологических жидкостях, экстрактах ткани и т.д.).

Штамм А-АСЕ-3G8 1

3,07

2,63

1:10

Формула изобретения

1 54

1: 100

Штамм гибридных культивируемых клеток мыши Nus musculus ВСКК (П) 25 N 26D (Специализированная коллекция перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН

СССР), используемый для получения моноклональных антител к ангиоте30 зин-превращающему ферменту легких человека, 0,50

1: 1000

Штамм 864, вырабатывающий антитела против липопротеидов низкой плотности из плазмы человека

0,330

Составитель М.Серова

Техред А.Кравчук

Редактор Н ° Гунько

Корректор С.Черни

Заказ 1935/24 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4