Способ определения ферментов, обладающих амидазной активностью

 

Изобретение относится к биоорганической химии, а именно к способам анализа ферментов, гидролизующих амидные связи. Пель - повъшение чувствительности способа определения. Способ заключается в том, что для определения амидазной активности ферментов к термостатированному водному раствору субстрата - 1 -(аминоацил)- -аминонафталин-5-сульфамида добавляют известное количество препарата фермента и полученный раствор инкубируют при постоянной температуре в течение фиксированного.интервала времени, после чего добавляют раствор проявителя , содержащий диазоль, например борфторид нитрофенилдиазония,и кислоту , останавливающую действие фермента . Полученный раствор красителя помещают в кювету спектрофотометра и определяют оптическую плотность в максимуме поглощения красителя. По величине оптической плотности рассчитывают количество продукта «реакции и далее активность фермента, сравнивая ее со стандартным образцом. 1 табл. (Л со ел ОО 00

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (51) 4 С 12 Я 1/00

ОПИСЛНИК HSOEPETEHHR

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4021732/31-13 (22) 10.02.86 (46) 23. 11.87. Бюл. Р 43 (71) Институт молекулярной генетики

АН СССР и 1-й Московский медицинский институт им. И.M.Ñå÷åíoâà (72) А.А.Недоспасов, В.Н.Незавибатько, А.Д.Яхимович, Т.Д.Большакова, В.А.Кузнецов и А.Я.Смоляницкий (53) 577. 15 (088.8) (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ, ОБЛАДАЮЩИХ АМИДАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ (57) Изобретение относится к биоорганической химии, а именно к способам анализа ферментов, гидролизующих амидные связи. Цель — повышение чувствительности способа определения.

Способ заключается в том, что для определения амидазной активности ферментов к термостатированному водному раствору субстрата — 1 -(аминоацил)-аминонафталин-5-сульфамида добавляют известное количество препарата фермента и полученный раствор инкубируют при постоянной температуре в течение фиксированного интервала времени, после чего добавляют раствор проявителя, содержащий диазоль, например борфторид нитрофенилдиазония,и кислоту, останавливающую действие фермента. Полученный раствор красителя помещают в кювету.спектрофотометра и определяют оптическую плотйость в максимуме поглощения краситепя. По величине оптической плотности рассчитывают количество продукта реакции. @ и далее активность фермента, сравнивая ее со стандартным образцом.

1 табл. С:

13

Изобретение относится к биоорганической химии, а именно к способам анализа ферментов, гидролиэующих амидные связи, Цел ь изобретения — повьнпе ние чувствительности способа.

Способ заключается в расщеплении под действием определяемого фермента аминоациламино-нафталинсульфамидов и спектрометрическом определении образующихся амино-нафталинсульфамидов цветной реакцией с солями арилдиазония, например 4-сульфофенилдиазония или 4-нитрофенилдиаэония.

Для определения амидаэной активности ферментов по предлагаемому способу к термостатированному водному раствору субстрата-1-(аминоацил)—

-аминонафталин-5-сульфамида, содержащему компоненты, необходимые для нормального функционирования фермента (например, соли, поддерживающие оптимальное значение рН), добавляют известное количество препарата .фермента, Полученный раствор инкубируют при постоянной температуре в течение фиксированного интервала времени, после чего добавляют раствор проявителя, содержащий диазоль, например борфторид нитрофенилдиазония, и кислоту, останавливающую действие фермента. Полученный раствор красителя помещают в кювету спектрофотометра и определяют оптическую плотность, предпочтительно, в максимуме поглощения красителя, используя в качестве раствора сравнения аналогичный по составу раствор, в который фермент был добавлен лишь после добавления проявителя. По величине оптической плотности рассчитывают количество продукта реакции и далее активность фермента, сравнивая ее со стандартным образцом.

Пример 1. Определение активности трипсина с использованием ,1-(N-карбобенэоксиаргинил)-аминонафу s талин-5-(N N -пентаметилен) -сульфамида.

Готовят следующие рабочие растворы.

P аствор 1 ° 1мИ 1-(N-карбобензоксиаргинил)-аминонафталин-5- N, N-пента53809 2 метиленсульфамида в 0,1 M трис-HCI1 буфере рН 7,8.

Раствор 2. 1 мМ борфторида нитро5 фенилдиазония в 0 9 М уксусной кислоУ те.

К 1 мл термостатированного при

25 С раствора 1 добавляют 10 мкл раствора фермента, перемешивают ВСтряхиванием, инкубируют 20 мин, бавляют 1 мл раствора 2, через 5 мин определяют оптическую плотность при

500 нм, используя в качестве раствора сравнения инкубировавшуюся смесь

1 мл раствора 1 и 1 мл раствора 2, в которую фермент добавляют после приготовления смеси. Содержание фермента определяют иэ отношения оптических плотностей анализируемого и стандартного растворов.

Аналогичным образом могут быть определены амидаэные активности других ферментов, Результаты опытов приведены в

25 таблице..

Использование изобретения позволит повысить чувствительность определения амидазной активности ферментов, что особенно важно при проведении э0 клинико-лабораторных исследований.

Формула и э о б р е т е н и я

Способ определения ферментов, обладающих амидазной активностью, предусматривающий проведение ферментативной реакции гидролиэа аминоацильного производного соединения нафталинового ряда, азосочетание продукта реакции с солью диазония с последующей регистрацией поглощения света, отличающийся тем, что, с целью повьппения чувствительности способа, в качестве субстратов ферментов используют 1-(ами4> ноацил)-аминонафталин-5-сульфамиды общей формулы ьО где R — аминоацил, ациламиноацил, пентидил; — сульфамидная группа.! 31:!809

О

I vm o cd е О О О О CI

° Oa ф Е О Ф Ch м со л C»I м

О

О!

1 о

I ccc

1 «б

C»I C»I

0-\

1 I

1 и

1 1-» а

an о

М С»1 СЧ л л л м м м м м3 л м

an с»а

Й!

О О а an ю м

А н и х

v х

»

I о

v х

v х а

X CO

Ф л л

-х

О а

Х Ф

» и! ЛО

° х

О О, + c»c ю ф

О

О а

v.

I а 1 юи

»5( .Л !! 1

1 cd а

1 и аЕа

5*é х х хи !

Х cd й! уу

Ф 1 1

И

1 I о

1-л са хо о Х!

5»

cd

I4 63

I4 о э ахld

O dI O

cd

cd х о а

М х х

1 cO

X о

Р н х х

v х х а

1в

I e баd!

О ф an aO Л Co Ch а

X х

I а а о о, 3

1 а

1 Ф

I e

1 Е

IO

1 хс» И

O I х О \ х

v x

I4 Х

Щ 8

О cd о х е о а х ц an

О ах

1 3

Ф х &

Й 1» Х cd

СхОЕ

G х

v х а

dl

М

Х о аф

О

В х

О а

В м и х

1% о, 1 йо

Ф а ccCa Q

О О.m

v ф хих

1 а

0 ао

Ф ñî

Ф ел

О

Ф ЙЗ

О а

an

1 хх

Ю х .Я 1» х х о е о х

1 о х а

1 (Ч

CO ю

О Х а