Способ выделения раковоэмбрионального антигена

 

Изобретение относится к медицине и предназначено для выделения раковоэмбрионального антигена (РЭА). Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта путемуменьшения этапов выделения до 2-х хроматографии и применения нового анионообменника. Проводят экстрацию РЭА из опухслевой ;гк анй. Ткань метастазов рака прямой кишки в печень гомогенизируют, гомогейат центрифугируют при 9000 g 30 мин. К супернатанту добавляют равный объем 2 М НСЮ, перемешивают 30 мик при 4 С. Осадок отделяют центрифугированием при 9000 g. Супернатант нейтрализу- , ют до рН 6,1 1М NaOH, концентрируют и диализуют. После диализа экстракт центрифугируют при 35000 g 30 мин. Проврдят ионообменную хроматографию на ДЕАЕ-32 целлюлозе. Затем проводят ионообменную хроматографию на АНР-сефарозе, затемгель-хроматографию на сефадексе G-200. Полученный препарат РЭА содержит одну белковую полосу при электрофорезе и полиакриламиднОм геле в присутствии додецилсульфата натрия. Иммуноэлектрофорез также дает одну полосу преципитации с полиспецифической антисывороткой. Молекулярная масса РЭА, определенная с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, составляет 180000 Д. со Oi со ел С5 ю

СООЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧЕСНИХ

РЕС!1УБЛИН

А1 (51)5 А 61 К 39 00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕ.ПАM ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ, (46) 23.03. 92. Бюп. Р 11 (21) 3794858/14 (22) 29.09.84 (71) Институт бйоорганической химии

АН БССР (72) Л. В, Шолькина, В. М. Шкуматов, А. И. Шербань и В. Л. Чащин (53) 615.36 (088.8) (56) Carr!co R. J., Uzatagui — Gomez М,—

Cancer Res., 975, ч. 35, № 11, р. 2928 — 2934. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ РАКОВОЭМБРИОНАЛЬНОГО АНТИГЕНА (57) Изобретение относится к медицине и предназначено для выделения раковоэмбрионального антигена (РЭА). Цель изобретения повышение выхода целевого продукта путем- уменьшения этапов выделения до 2-х хроматографий и применения нового анионообменника. Проводят экстрацию РЭА из опухслевой ткани. Ткань метастазов рака прямой кишки в печень гомогенизируют, гомогеиат центрифугируют при 9000 g

n„SU,, 1363562

30 мин. К супернатанту добавляют равный объем 2 M HC104, перемешивают 30 мин при

4 С. Осадок отделяют центрифугированием при 9000 g. Супернатант нейтрализуют до рН 6,! 1М NaOH, концентрируют и диализуют. После диализа экстракт центрифугируют при 35000 g 30 мин. Г1роводят ионообменную хроматографию на ДЕАЕ-32 целлюлозе, Затем проводят ионообменную хроматографию íà АНР-сефарозе, затем-гель — хроматографию на сефадексе G — 200.

Полученный препарат РЭА содержит одну белковую полосу при электрофорезе b полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Иммуноэлектрофорез также дает одну полосу преципитации с полиепецифической антисывороткой. Молекулярная масса РЭА, определенная с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. составляет - 180000 Д.

1363562

Формула изобретенИя

Составитель М. Васильев

I <.< . <; I I <>1

3зка.1 3! 6 Тираж 489 Поднисное

I, :I ll1 I " .<;<рс в< ни»го.комитета СССР sso делам изобретений и открытий

I I,311.I8<. Москва, Ж--З5, Раушская наб., д. 4/о

< . »««во.н«рафииегкое предприятие, г. Ужгород, ул. Иро< ктн«я. 4

ИзобрРтен13е относ11тг13 к м1 л1111ине..

1(сль1о изобретения явл31отси повышение выхода целевого продукта за счет уменьшения этапои fff f)IEления до 2-х хроматографий и применения нового, анионообменника.

/7ример..Экстракцин раковоэмбрионального антигена (РЗЛ) из опухолевой ткани.

1 Kf ткани метастазов рака примой кишКИ В ПЕЧЕНЬ ИЗМЕЛЬЧаЮт И гОМОГЕНИЗИ!3УЮТ в 2 л 0,01 М натрий-фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 0,15 м NaCI, при

8000 об/мин в течение 5 мин. Гомогенат центрифугируют при 9000 g в течение 30 мин.

К супернатанту добавля1от равный объем

2 М НС104, перемешивают в течение 30 мин при 4 С. Осадок отдел нот центрифугированием при 9000 g и течение 30 мин. Супернатант нейтралпзу1о1 до рН 6,0 М NaOH концентрируют ультрафильтрацией на мембранном фильтре «Рипор-1-120;> до объема 240 мл и диализиру1от против дистиллированной воды (2 смены по 4 л) в течение 12 ч при 4 С, затем против 0,01 М натрий-фосфатного буфера (рН 7,4) (2 смены по 4 л) в течение 12 ч при 4 С, После диализа экстракт центрифугируют при 35000 g в течение 30 мин.

И."™ообмениая хроматография на

ДЕАЕ 32-целлюлозе:

Полученный экстракт наносят на колонку

3,5Х23 см с ДЕАЕ-32 целлюлозой, уравновешенну1о 0,01 N натрий-фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим 0,02о/„ Майлз. Элюирование осуществляют линейным градиентом Π— 0,2 М МаС! в этом же буфере. Скорость элюирования 10 мл/ч, объем элюирующего буфера 900 мл. Фракции (общий объем

220 мл), содержащие РЭА, после концентрирования ультрафильтрацией до 60 мл диализируют против 0,0! М натрий-фосфатного буфера (рН 7,4) в течение 12 ч при 4 С.

Ионообменная хроматография !3а

AHP-сефарозе.

Объединенную фракцию после хроматографии на ДЕЛЕ-32-пеллюлозе наносят на колонку 2,2Х13 см с ЛНР-сефарозой, уравновешенную 0,01 М натрий-фосфатным буфером (р Н 7,4), содержа щим 0,02Я Na Мз.

Промывают колонку IОО мл стартового буфера со скоростью 10 мл/ч. Элюирование осуществляют ли<1ей 1, м градиентом О—

0,1 М ХаС! в 0,01 М натрий-фосфатном буфере (pH 7,4), содержащим !),02Я

NaN3. Скорость элюирования 10 мл/ч, объем элюирующего буфера 560 мл, Фракции (общий объем 270 мл), содержащие РЭА, концентрируют ультрафильтрацией до 6 мл.

Гель-хроматография на сефадексе 6-.200.

Объединенную фракцию после хроматографии на AHP-сефярозе наносят на колонку

2,5Х78 см с сефадексом G-200, уравновешенную 0,0! М натрий-фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим 0,5 М NaCI u

0,020 Na Nq. Эл юи рова н не проводят со скоростью 10 мл/ч. Фракции, содержа щие

РЭА, объединяют, диализируют против дис15 тиллированной воды и лиофилизируют.

Количество выделенного РЭА {концентрацию РЭА определяли с помощь о коммерческого набора СЕАК-P R фирмы «113tef13ationa! CIS») составляет 120 мг или 12о от содержания его в экстракте.

Полученный данным способом препарат

РЭА содержит одну белковую полосу при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецил сульфата катр ия. Им муноэлектрофорез также дает одну полосу преципитации с полиспецифической антисывороткой (кроличья антисыворотка к экстракту из опухолевой ткани). При повторной гельхроматографии препарата РЭА на сефадексе

G-200 получен один симметричный пик.

Молекулярная масса Р3А, определенная

gg с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, составляет 180000 Д:

Способ выделения раковоэмбрионального анти гена путем экстр акции опухолевой ткани хлорной кислотой с последу!о-. шей ионообменной хроматографией экстракта на ДЭАЭ-целлюлозе и гель-хроматографией на сефадексе G-200, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, после хроматографии на ДЭАЭ- целлюлозе дополйительно проводят хроматографию на аминогидроксипропил-сефарозе с элюцией целевого продукта линейным градиентс)м концентрации хлористого натрия

0 — О,! М в 0,01 М натрий-фосфатном буфере рН 7,4.