Штамм гибридных культивируемых клеток мыши mus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к поверхости эндотелиальных клеток пупочной вены человка

 

. Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано при идентификации иммуногистохимических срезов органов и тканей человека и типировании опухолей эндотелиального происхождения. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши MUS musculus,.длительно продуцирующего моноклональные антитела (МА) к поверхности эндотелиальных клеток пупочной вены человека. Штамм НЕ25 получают гибридизацией спленоцитов мышей линии BALB / С, иммунизированных суспензией эндотелиальных клеток, с клетками миеломы F3/Ag 8.653. Штамм вы-- водят в массовую культуру. Он хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК (n)N33D и характеризуется следующими признаками. Клетки штамма культивируют в пластиковых флаконах в среде RPMI 1640 с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки в атмосфере 5% СО при 37 С, При культивировании в организме жи- : вотных асцит образуется через 12- 16 дней. Концентрация МА в асцитической жидкости составляет 10 мг/мл, в kyльтypaльнoй - 1-10 мкг/мл. МА относятся к классу IgGl. Они специфически связьшаются с антигенами на поверхносо-и эндотелиальных клеток из пупочной вены человека, а также с гладкомышечными клетками из аорты человека в культуре. 1 табл. с S (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

f19) (11) (51) 4 С 12 И 5/00 А 61 К 39/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4071889/28-13 (22) 27.05.86 (46) 30.12.87. Бюл. У 48 (71) Всесоюзный кардиологический научный центр AMH СССР (72) А.В.Рудин, С.M.Данилов, Н.В.Попов, Н.В.Гончаров, А.В.Мартынов и С.П.Домогатский (53) 578.085.23 (088.8) (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК МЫШИ MUS MUSCULUS ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ПОВЕРХНОСТИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ

КЛЕТОК ПУПОЧНОЙ ВЕНЫ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано при идентификации иммуногистохимических срезов органов и тканей че.— ловека и типировании опухолей эндотелиального происхождения. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши

Mus muscu1us, длительно продуцирующего моноклональные антитела (МА) к поверхности эндотелиальных клеток пупочной вены человека. Штамм НЕ25 получают гибридизацией спленоцитов мышей линии ВА?.В / С, иммунизированных суспензией эндотелиальных клеток, с клетками миеломы РЗ/Ag 8.653. Штамм выводят в массовую культуру. Он хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии AH СССР под номером ВСКК (П)N33D и характеризуется следующими признаками. Клетки штамма культивируют в пластиковых флаконах в среде RPMI 1640 с добавлением 207 эмбриональной телячьей сыворотки в атмосфере 5Х СО при 37 С.

При культивировании в организме животных асцит образуется через 1216 дней. Концентрация МА в асцитической жидкости составляет 10 мг/мл, в культуральной — 1-10 мкг/мп. MA относятся к классу IgGl. Они специфически связываются с антигенами на поверхноса è эндотелиальных клеток из пупочной вены человека, а также с гладкомышечными клетками из аорты человека в культуре. 1 табл.

1362746 признаками, 10

11

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при идентификации иммуногистохимических срезов органов и тканей человека и типировании опухолей эндотелиального происхождения.

Целью изобретения является получе-! ние штамма гибридных культивируемых клеток мыши Mus пызсп1пз, используемого для получения моноклональных антител к поверхности эндотелиальных клеток пупочной вены человека.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии BALB/Ñ иммунизируют введением 1 мпн. культивируемых эндотелиальных клеток пупочной вены человека в 1-5 пассажей. Клетки выращивают на пластике, покрытом желатином, в среде 199 на солях Эрла с добавлением 20% человеческой сыворотки. Нрпосредственно перед иммунизацией клетки с нимают с подложки механич еским путем, отмывают от сывороточных белков средой 199, суспендируют в

О, 5 мл той же среды и вводят в мышь внутрибрюшинно. Через 10 и 20 дней после первого введения проводят дополнительные иммунизации аналогичным образом. Через 3 дня после последней иммунизации иммунных мышей забивают, 15х10 клеток селезенки гибридизуют т т с 5х10 клеток миеломы мьппи P3/Ag.

8.653 в течение 1 мин в присутствии

0,7 мп раствора, содержащего 45 об,7. полиэтиленгликоля (ПЭГ) мол. массы

4000 и 15% диметилсульфоксида. После гибридизации и отмывки клеток средой

199 от .ПЭГ клетки высевают в 96-луо ночные панели по 1х10 клеток в лунку. Для культивирования и селекции гибридов используют среду ДМЕМ с добавлением 207 эмбриональной коровьей сыворотки, 100 мкМ гипоксантина, 0,4 мкМ аминоптерина и 16 мМ тимидина.

Гибриды отбирают по способности продуцировать антитела к поверхности культивируемых эндотелиальных клеток.

Отобранные гибриды дважды клонируют методом конечных разведений. После повторного клонирования практически

100% субклонов продуцируют антитела к эндотелию. Продукция антител сохраняется по крайней мере до 20-го пассажа.

Продуктивные субклоны выводят в массовую культуру и обозначают НЕ25.

Штамм НЕ25 хранится в Специализиро30

55 ванной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных под номерам 33D и характеризуется следующими

Культуральные признаки.

Культивирование гибридных клеток

HF25 проводят в пластиковых флаконах в среде RPMI 1640 с добавлением 207 эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 10 мМ пирувата натрия, 100 мкг/мл пенилициллина и стрептомицина, 0,05 мМ 2 — меркаптоэтанола и 0,157 гидрокарбоната натрия в атмосфере 5Х углекислого газа при о

37 С. Посевная доза 10 — 100 тыс. клеток в мл, плотность в монослае б

1х10 клеток на кв. см. Культуру пассируют как суспензианную в дозе 10100 тыс, клеток в 1 мл 1 раз в 5 дней или в дозе более 100 тыс. клеток в

1 мл 1 раз в 3 дня.

Клетки штамма НЕ25 культивируют в организме животных. Интактным мышам линии BALB/Ñ за 10 дней до инъекции штамма вводят по 0,5 мл пристана.

Штамм инъецируют в/брюшинна по 1-5х х10 клеток в 1 мл среды Игла. Асцит образуется через 12-16 дней. Возможна по крайней мере двухкратная перевивка штамма.

Продуктивность штамма..

Секреция моноклональных антител на 3-4-й день культивирования зависит от посевной дозы и варьирует в диапазоне ат 1 до 10 мкг/мл культуральной среды и 10 мг/мл асцитической жидкости. Концентрацию антител определяют иммуноферментным методом.

Стабильная продукция антител сохраняется до ?О-го пассажа in vitro, Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и при посевах на питательные среды, Заражение микоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК.

Криаконсервирование.

Клетки штамма кансервируют па 1х х10 клеток/мл коровьей сыворотки с добавлением 10Х диметилсульфоксида в пластиковых ампулах. Замораживание ампул проводят в коробке из вспененного полистирола с толщиной стенок

1 см. Коробку с ампулами оставляют при — 70 С и через сутки переносят ампулы в жидкий азат для хранения.

Размораживание проводят быстро в о водяной бане при 37 С. Жизнеспосаб1362746 ность после ра мораживания по включению трипановаго синего 60/.

Характеристика полезного продукта.

Моноклональные антитела относятся к классу Ig01 Антитела специфически связываются с антигенами на поверхности эндотелиальных клеток пупочной вены человека, а также с гладкомышечными клетками из аорты человека в культ уре.

Пример 1. Культуральную среду от штамма НЕ25, содержащую моноклональные антитела в концентрации

10 мкг/мл, собирают, центрифугируют в течение 10 мин при 800 g. Надосадочную жидкость используют как реа гент для изучения специфичности связывания антител с компонентами сосудистой стенки человека.

Клетки-мишени высевают в 96-луночные панели из полистирола, выращивают до достижения монослоя в соответствующей среде с сывороткой, отмывают от сорбировавшихся белков забуференным физиологическим раствором (ЗФР) и, если необходимо, фиксируют в 47-ном фармальдегиде в изотоническом солевом растворе 5 мМ NaH РО, 140 мМ NaC1, 1 мМ СаС1, 1 мМ МдС1 . Г1осле 20 мин фиксации при 20 С избыток формальдегида отмывают ЗФР. Затем несорбировавшийся на пластике белок удаляют, ячейки промывают 5 раз, вносят в них по 50 мкл культуральной среды от штамма НЕ25 и инкубируют 30 мин при о

37 С. Несвязавшиеся антитела отмывают

ЗФР 5 раз, в ячейке вносят ковалентна связанные с пераксидазой хрена антитела кролика против иммуноглобулинов мьпии в 50 мкл среды 199 с 10 телячьей сыворотки. Через 30 мин инкубао ции при 37 С несвязавшиеся антитела отмывают указанным способом, а количество оставшейся в ячейках пероксидазы, пропорциональное количеству антител, определяют по расщеплению субстрата (Н 0 ) в присутствии хромогена ортофенилендиамина. Положительная реакция проявляется изменением окрашивания от желтого до коричневого и просчитывается на спектрафотометре при длине волны 490 нм.

Результаты экспериментов по изучению специфичности связывания иммуноглобулинав из культуральной среды штамма НЕ25 с различными культивируемыми клетками, выраженные в единицах оптической плотности, при длине волны

490 нм представлены в таблице.

Результаты, приведенные в табли5 це свидетельствуют о высокой специфичности взаимодействия антител с энцотелиальными клетками пупочной и легочной артерии по отношению к фибробластам кожи в диапазоне исследованных концентраций.

Специфичность по отношению к глад55

50 комышечным клеткам относительна.

Пример 2. Культуральную среду от штамма НЕ25, содержащую антитела, получают так же как в примере 1.

На дно ячеек 96-ячеечной полистироловой панели сарбируют коллаген

I, III, IV u V-типов, фибриноген и фибранектин человека, с которыми опредепяют связывание антител. Для этого в ячейки вносят па 50 мкл раствора белка в 200 мМ бикарбонатном буферном растворе рН 9,0 с концентрацией

10 мкг/мл и оставляют на 16 ч при

4 С. После трехкратной промывки ЗФР в ячейки вносят по 500 мкл культуральнай среды от штамма НЕ25 и инкубируют 30 мин при 37 С. Дальнейшие промывки, инкубацию с антителами кро лика против иммунаглобулинов мйши, конъюгированными с пераксидазой, и проявление реакции связывания проводят также, как описано в примере 1.

Измерение оптической плотности при 490 нм показывает, что в диапазоне концентраций антител от 0,15 до

10 мкг/мл связывание их с коллагенами, фибриногеном и фибранектином человека не выявляется, оптическая плотность в ячейках 0,050 и не зависит от концентрации антител. В тех же условиях и в тех же диапазонах концентраций антитела, полученные к коллагенам I u III типов реагируют, давая величину оптической плотности

0,070 — 0,920, а антитела к фибронектику — 0,060-0,500 при взаимодействии с каллагенами I, III типов и фибронектином соответственно.

Таким образом, реакция исследуемых антител с коллагенами I, III, IV и V типов,,фиброчектином и фибриногеном человека отсутствует.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток мыши Низ m«sculus ВСКК(П)ИЗЗЭ (Специализированная коллекция перевиКонцентрация антител, мкг/мл

I I l I

Клетки

10 2,5 0,6 0,3 О, 15

Эндотелий пуповины

0,800 О, 760 0,600 0,200 О, 100

Эндотелий легочной артерии 0,807 0,760 0,610 0,215

Гладкомышечные клетки 0i25О 0,230 О, 180 О, 130 0,040

Фибробласты кожи

0,100 0,100 0,100 0,100 0,100

Составитель M.Ñåðîâà

Редактор П.Лазоренко Техред M.Äööûê Корректор В.Бутяга

Заказ 6348/17 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

1362746

6 ваемых соматических клеток позвоноч- нальных антител к поверхности эндоте- ных Института цитологии АН СССР), лиальных клеток пупочной вены челоиспользуемый для получения монокло- века.