Способ получения тимозина из тимусов млекопитающих

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

А1

„„SU„„1255136 (1) 4 А 61 К 35/55, 35/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ э

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

К ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3824833/28-14 (22) 18.12.84 (46) 07.09.86. Бюл. 9 33 (72) Г.К.Коротаев, О.М.Тепелина, В.А.Лившиц, Т.И.Жеребова, И.К.Шпрунка, Э.А.Калнина, Н.И.Колкина, А.Я.Степка, О.Г.Саканделидзе, Е.С..иршович, Н.С.Дрожжина и А.О.Ружицкий (53) 612.017.11/12(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N9 975017, кл. А 61 К 35/56, опублик.

23.11.82. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТИМОЗИНА ИЗ

ТИТУСОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ,включающий гомогенизацию тимусов, разрушение клеток, экстракцию раствором хлористого натрия, осаждение твердых частиц ткани центрифугированием, удаление из супернатанта термолабильных белков при нагревании, освобождение от пигментных и пирогенных веществ, осаждение целевого продукта ацетоном с последующей его очисткой путем солевого фракционирования, гель-хроматографии, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения выхода целевого продукта, разрушение клеток проводят при перемешивании гомогената со скоростью 500-2000 об/мин в течение 1 — 1,5 ч, термолабильные белки удаляют при нагревании в течение 15-20 мин, в качестве элюента при гель-хроматографии используют бикарбонат ам- 3 мония, 1255136

Изобретение относится к медицине, в частности к получению гормонального фактора тимуса.

Цель изобретения — повышение выхода целевого продукта и упрощение спо- 5 соба путем использования определенного режима клеток и приемов очистки.

Пример 1. Получение сырца тимозина.

500 г слегка дефростированных же 10 лез (тимуса телят) измельчают на мясорубке. Измельченный тимус порциями гомогенизируют в размельчителе тканей PT-l, добавляя частями (1,5 лу

0,15 M раствора хлористого натрия. IS

Каждую порцию гомогениэируют в течение 3 мин. Полученный гомогенат перемешивают в течение 1 ч с помощью механической мешалки при 8 — 10 С скорость перемешивания 500 об/мин . По 20 окончании экстракции жмых отделяют центрифугированием при 2500-3000 об/ мин в течении 30 мин при 4 С. Супернатант нагревают в водяной бане с температурой 100 С до 80 С в течение 15 мин. Горячую смесь охлаждают в бане со льдом, осадок термолабильных белков отделяют центрифугированием при

2500-3000 об/мин в течение 30 мин при о

4 С, а супернатант фильтруют через 30 асбесто-целлюлозную пластину типа ЕКС, I

Прозрачный, охлажденный экстракт (1,24 л) вливают при постоянном перемешивании в 5 объемов .(6,2 л) хо-, лодного (-10 С) ацетона, помещенного в фарфоровую емкость и оставляют в холодильнике.

Через 12-16 ч надосадочный раствор сифонируют. Осадок высушивают на воронке Бюхнера, промывая 3-4 раза аце- 4О тоном (около 1 л). Высушенный порошок тщательно растирают в течение

2-3 ч, сушат на воздухе до полного удаления ацетона. Получают 9,0 r сырца тимоэина.

Получение субстанции тимозина.

1) Солевое фракционирование.

Полученный сырец растворяют в

0101 М натрий-фосфатном буфере с рН 7,0 в соотношении 1:10 — 9,0 г 50 сырца в 90 мл буфера — и в течение

30 мин перемешивают на магнитной мешалке при комнатной температуре.

Полученный раствор центрифугируют в течение 15 мин при 3000 об/мин и SS

4 С.

К супернатанту добавляют насыщен ный раствор сульфата аммония из расчета 3 объема супернатанта и 1 объем насыщенного раствора, в котором предварительно установлен рН 7,0 с помощью водного раствора аммиака. Смесь перемешивают при 6-8 С в течение 1 ч.

Центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин при 4 С.

Затем в супернатанте устанавливают рН 4,0-4,05 с помощью 107-ного раствора уксусной кислоты. В полученный раствор добавляют 15,8 г сульфата аммония из расчета 14,6 г сульфата аммония на 100 мл раствора. Смесь перемешивают в течение 1 ч при 6-8 С и оставляют в холодильнике на ночь (18-20 ч) . Осадок отделяют центрифугированием в течение 15 мин при

3000 об/мин и 4 С.

2) Обессоливание и лиофильное высушивание.

Влажный осадок растворяют в 90 мл

0,01 M теис -НС1 буфере (рН 8,0) в течение 30 мин, перемешивая на магнитной мешалке при 6-8 С, нерастворившуюся часть отделяют центрифугированием при 3000 об/мин и 4 С. Раствор наносят на колонку (50 .1000 мм), заполненную сефадексом Г-25 и элюируют

0,05 11 раствором бикарбоната аммония со скоростью 100 мл/ч. Фракции, соответствующие первому пику поглощения, объединяют и лиофильно высушивают

Получают 0,65 r тимоэина.

Выход тимозина из тимуса телят составляет 1,3 г из 1 кг железы.

П р и и е р 2. Аналогично примеру 1. Экстракцию проводят 1,5 ч.

Выход тимозина 1,35 r иэ 1 кг железы.

Пример 3. Аналогично примеру 1. Экстракт после отделения жмыха термостатируют 20 мин, Выход тимозина

1,35 г из 1 кг железы.

Пример 4. Аналогично примеру 1. Тимозин получают из свежезамороженных вилочковых желез ягнят. Выход тимозина 1,4 ã.

Пример 5. Аналогично примеру 8. Тимозин получают из вилочковых желез тюленей. Выход тимознна 1,2 г из 1 кг железы.

Пример 6. Аналогично примеру l. Экстракт перемешивают со скоростью 2000 сб/мин. Выход тимозина

1,35 г иэ 1 кг железы.

Положительный эффект заключается в повышении выхода целевого продукта в 5-6 раз.