Способ структурной и репликативной стабилизации экспрессируемых рекомбинантных плазмид в популяции микроорганизмов
Изобретение отноо1тся к микробиологической промышленности и генетической инженерии, в частности к прориышпенному опытному и лабораторному производству полезных соединений с помощью микроорганизмоа содержащих рокомбинантные плазмиды, за счет которых осущесшплется синтез попезных прощтаов. Создан способ, обеспечивающий стабильность экспрессии рекомбинантных плазмид. заотючающийся в том, что для сохранения генет еской структуры этих плазмид микроорганизмы культивируют в условиях подцержанного извне непимитированного роста. 2 табл.
(51) % С )AN 15 00
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННОЕПАТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК TOPCKOMy СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 40?2204/13 (22) 3005.86 (46) 30.11.93 Бюп. N() 43 — 44 (71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР (72) Вельков В.В.; Матыс B.)0.; Мутафов С.Б(BG);
Ерошин В.К (54) СПОСОБ СТРУКТУРНОЙ И РЕПЛИКАТИВНОЙ СТАБИЛИЗАЦИИ ЭКСПРЕССИРУЕМЫХ
РЕКОМБИНАНТНЫХ ПЛАЗМИД В ПОПУЛЯЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ (57) Изобретение относится к микробиологической (в) я (и) 1389297 лт промышленности и генетической инженерии, в частности к промышленному опытному и лабораторному производству полезных соединений с помощью микроорганизмов. содержащих рекомбинантные плазмиды, за счет которых осу)цес) впяется синтез попезных продуктов. Создан способ, обеспечивающий стабильность экспрессии рекомбиHBHTHblx плазмид, заключающийся в 70М, что дпя сохранения генетической структуры этих ппазмид микроорганизмы культивируют в условиях поддержанного извне нелимитированного роста 2 табл.
1389297
20
35
Изобретение относится к микробиологической промышленности и к генетической инженерии, и частности к промышленному, опытному и лабораторному производству полезных соединений с помощью микроорганизмов, содержащих рекомбинантные плазмиды, за счет которых осуществляется синтез полезных продуктов.
Способ, обеспечивающий стабильность экспрессии рекомбинантных плазмид, закл счается в том, что для сохранения генетической структуры этих плазмид микроорганизмы культивируют в условиях поддер>киьаемаго извне нелимитираванна"
ГО pocta, П " и м е р 1, Культивируют штамм метилатрафных дрожжей . Hansenuta
polymorpha 0(=1 leu 2, неспособный синтезировать лейцин, несущий рекомбинантную плазмиду р1 2, с геном teu2, обеспечивающим синтез лейцина в режиме хемостата на среде, «е содержащей лейцин. Инокулят вырашивают а колбе объемом 500 мл, в котоpylo помеща от 200 мл среды!! Е слеДующего состава (мг/n): КН2Р04 1000, Mg SO< 7Hz0
500; NH 0,16, Мп304 5Н20 0,66; CoCtz 6Н20 0,18, биотин О, t; тиамин 0,4; метанол 5000. Непрерывное культивирование проводят в хемастате при =36 С, pH=5,0; рО2 30% от насыщения, Заданное значение рН поддержи" ale r 5 О-ным раствором аммиака. Об усанавлении стационарного хемостатного режима культивирования судят по установлению постоянных значений оп1 ич8ской плотности культуры, скорости потребления титранта и îíöåíòðàöèè растворенного кислорода, а также по содержанию остаточного метанола. При хемостатнам культивировании штамм- H.polymorpha 01 -1 leu2, содержащего рекамбинантну о плазмиду pL2, проводившемся в двух независимых экспериментах при скоростях протока (объемного разбавления) G,05 ч, 0,13 ч обнаружена, что при данных режимах лимитированного культивирования доля плазмидных клеток в популяции возрастает; вс8 проверенные рекомбинантные плазмиды претерпевают значительные структурные изменения. При этом происходит значительное увеличение молекулярной массь плазмиды pL2 от 8,2 Md, характерного для исходной, до 45-60 Md для рекомбинантных плазмид, выделенных из клеток, прошедших хемастатное культивирование, Таким образом, контрольные эксперименты демонстрируют, что хемастатнае культивирование микроорганизмов, содержащих рекомбинантные плазмиды, приводит к тому, что в ферментере накапливаются клетки с измененной структурой рекомбинантных плазмид, что полностью согласуется с результатами, полученными ранее исследователями, Это означает, что хемостатное культивирование микроорганизмов, содержащих рекомбинантные плазмиды, не обеспечивает сохранения генетической структуры рекомбинантных плазмид и не может быть использовано в практике (табл.1). Пример 2. Штамм метилотрофных дрожжей Н.poiymorpha DL-1 leu2, несущий рекамбинантную плазмиду р(2, культивируют в условиях рН-ауксостата. Инокулят готовят так, как указано в примере 1, для непрерывного культивирования используют среду ttE (пример 1) и ферментационную установку. цля того чтобы обеспечить культивирование s режиме рН-ауксостата, компоненты питательной "ðåäû подают с одинаковой объемной скоростью двумя пневматическими дазирующими насосами (дозаторами), которые синхронно управляются импульсами системы автоматической коррскции.рН. Рабочий объем дозаторов калибруют прямыми измерениями дозы питательной среды встроенной бюреткой согласно инструкции по эксплуатации ферментера. Правильность калибровки контролируют по ходу эксперимента. Скорость протока определяют по счетчику импульсов, поданных на дазиру ащие насосы за определенное время, обычно в течение 1 ч,. В результате рН-ауксостатного культивирования штамма Н.polymorpha 01 -1 leu2, содержащего рекомбинантную плазмиду pL2, устанавливают, что количества плазмидных клеток на всем протяжении культивирования составляет 60 — 70%, при этом все проверенные кланы, прошедшие 1.6,52 генераций, содержат рекомбинантные плазмиды, идентичные исходной (табл.2). Скорость проток- в конце культивирования 0,17 — 0,18 ч . Пример 3. Культивируют штамм Hansenuia poiymorpha 0L-1 leu2, несущий рекомбинантную плазмиду pL2, в режиме рН-аукСостата на среде 11 Е, содержащей в качестве единственного источника углерода и энергии 5000 мг/л этанола. В этих условиях доля плазмидных клеток в популяции на всем протяжении культивирования сОс;ав ляет 60-70 4 и подавляющее большинство плазмидных клеток (90-100%), прошедших 1, 5, 80 генераций, содержи1 рекамбинантные плаэмиды с неизмен;.и:-руктурай 1389297 культивирования доля плазмидных клеток составляет 60-80 (и плазмидные клет".è, выделенные на 1, 5, 95 генерациях. в подавляющем большинстве (90-100$) содержат рекомбинантные плазмиды, по своей структуре идентичные исходной (табл.2). Скорость протока составляет в конце культивирования 0,41 ч Таблица 1 Нестабильность штамма H. ро1уаогрйа ОИ teu2, содержащего рекомбинантную плазмиду pL2 при хемостатном режиме культивирования Пр и м е ч а н и е: В табл,1 и 2 при определении коли <ества плгмидных клеток в популяции исследовалась выборка из 500 — 600 клеток. При определении измененности структуры плаэмид исследовалось по 10 дрожжевых клонов, полученнь!х hB указанных генерациях >(емостат-. ного культивирования. Таблица 2 Стабильность штамма Н. polymorpha DL-11еи2, содержащего рекамбинантную плазмиду pL2, при рН-ауксостатном культивировании Количество клеток с неизмененной плазИИДОи, j, ство плазмид- ток в (Рермен-1 сф ключающийся B том, .та микроорганизмы, содержащие рекомбинантные пла314иды, культивируют в условиях пордерживаамого 5 извне нелимитированного раста. (табл.2), Скорость протока, установившаяся в процессе роста, составляет 0,27 ч 1. Пример 4. Культивируют штамм Hansenule polyrnorpha DL-.1 feu2, несущий рекомбинантную плазмиду pL2, в режиме 5 рН-ауксостата, как описано в примере 2, на среде 11 Е, содержащей в качестве субстрата 5000 мг/л глюкозы. На всем протяжении Формула изобретения СПОСОБ СТРУКТУРНОЙ И РЕПЛИКАТИВНОЙ СТАБИЛИЗАЦИИ ЭКСПРЕССИРУЕМЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ ПЛАЗМИД В ПОПУЛЯЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ, за45 100 ос 10l 100
