Способ приготовления биферментного электрода для определения сахарозы

 

Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к способам изготовления ферментных электродов для определения сахарозы в биологических средах, и может быть использовано в медицине, пищевой и микробиологической промышленности. Цель изобретения - упрощение способа и улучшения качества электрода за счет повышения воспроизводимости его характеристик. Способ заключается в следующем: пирографитовьй электрод выдерживают в растворе акриламида N,N -бис-метиленакриламида и глюкозооксидазы при потенциале (-1,)-(- ,2)В, а затем переносят в водный раствор поливинилового спирта, содержащего борную кислоту и инвертазу и также вьщерживают при потенциале (-1,1) - (-1,2)В, а затем обрабатывают Мембрану глутаровым альдегидом. Способ позволяет упростить процесс получения электрода, а также улучшить его качество за счет повышения воспроизводимости его характеристик. 1 табл. о S (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

5 А1 (19) (11) (51) 4 С 12 1/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4107709/31-13 (22) 18.08.86 (46) 15.05.88. Бюл. В 18 (71) Институт электрохимии им. А.Н.Фрумкина (72) К.А.Макаров, Я.Д.Зытнер, Л.С.Тихонова, О.Г.Кузнецова, В.А.Богдановская и В.Г.Воробьев (53) 577.15 (088.8) (56) Кулис Ю.Ю. Аналитические системы на основе иммобилизованных ферментов. Вильнюс: Мокслас, 1981, с. 200.

Щеллер Ф. и др. Биоспецифические сенсоры. " Прикладная биохимия и микробиология, 1982, т. 18, В 4, с. 354. (54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ БИФЕРМЕНТНОГО ЭЛЕКТРОДА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ САХАРОЗЫ (57) Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к способам изготовления ферментных электродов для определения сахароэы в биологических средах, и может быть использовано в медицине, пищевой и микробиологической промышленности.

Цель изобретения — упрощение способа и улучшения качества электрода за счет повышения воспроизводимости его характеристик. Способ заключается в следующем: пирографитовый электрод выдерживают в растворе акриламида

/ . N,N -бис-метиленакриламида и глюкозоо-, ксидазы при потенциале (-1,1)-(-,2)В, а затем переносят в водный раствор поливинилового спирта, содержащего борную кислоту и инвертазу и также выдерживают при потенциале (-1,1) (-1,2)В, а затем обрабатывают мембрану глутаровым альдегидом. Способ позволяет упростить процесс получения электрода, а также улучшить его качество за счет повышения воспроизводимости его характеристик. 1 табл.

1395675

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к способам изготовления ферментных электродов для определения сахарозы н биологических средах, и может быть использовано в медицине, пищевой и микробиологической промышленности.

Цель изобретения — упрощение спо соба и улучшение качества электрода sa счет поььппения воспроизводимости ! его характеристик.

Способ осуществляют следующим образом.

Пирографитовый электрод выдержива- 15 ют в растворе акриламида N,N -бисметиленакриламида и глюкозооксидазы при потенциале (-1,1) — (-1,2)В (относительно водородного электрода в том же растворе), а затем переносят в водный раствор поливинилового спирта, содержащего борную кислоту и инверта зу и также выдерживают при потенциале (-1,1) " (-1,2)В ° Время, в течение которого необходимо выдерживать элект- 5 род в том и другом растворе, зависит от того, какой толщины мембрану нуж,но получить и может изменяться от

1 10 с до 3-5 мин. В процессе поляриза. :ции электрода при данном потенциале на электроде адсорбируется глюкозооксидаза и образуется мембрана из поли, :акриламидного геля, содержащая глюко1, зооксидазу, включенную в мембрану. В ! растворе поливинилового спирта, со3" держащего борную кислоту и инвертазу

:при катодной поляризации происходит !

I подщелачивание приэлектродного слоя

1 в результате выделения водорода, в результате .изменения рН происходит сшивание поливинилового спирта анионами борной кислоты (тетрагидроксоборат-анионами}. Образующаяся мембрана поливинилового спирта содержит инвертазу, включенную в объем мембраны.

Мембрана из поливинилового спирта в процессе работы может растворяться, поэтому для повышения ее стабильности производят сшивание глутаровым альдегидом.

Методика изготовления электрода упрощается, так как процесс осуществляется в одну стадию, а также повьппается активность и воспроизводимость характеристик электрода благодаря тому, что адсорбируется большее количество ферментов, которые равномерно распределяются на поверхности электрода и по толшине мембраны, кроме тоro мембрана достаточно тонкая и равномерная по толщине и характеристики ее воспроизводятся от опыта к опыту.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример I. Пирографитовый электрод опускают в ячейку с водным раствором, содержащим г/л: акриламид

350; N,N -бис-метиленакриламид 25; хлорид цинка 20; глюкозооксидаза.0,5.

На пирографитовом электроде поддерживают потенциал, равный -1,1 В относительно водородного электрода в том же растворе, противоэлектрод — анод используют из пластины или нержавеющей стали. Процесс ведут при комнатной температуре в течение 2 мин. Затем электрод промывают водой и опускают в ячейку с водным раствором, содержащим, г/J1: поливиниловый спирт 80; борная кислота 4; инвертаза О,б.Электролитом служит ацетатный буферный раствор рН 5,0. На пирографитовом электроде поддерживают потенциал

-l,l В. Процесс проводят 15 с. После этоГо электрод промывают и помещают в раствор глутарового альдегида для сшивания поливинилового покрытия.

Раствор для сшивания содержит

0,125 мас.% глутарового альдегида и

14,0 мас.% хлорида натрия в воде.

Толщина образующейся мембраны в выбранном интервале времени составляет 25 мкм.

Пример ы 2-5. Все операции, как в примере 1, кроме потенциала, при котором проводили получение мембраны на электроде. Потенциал составляет для примера 2 — (1,15)В; 3 (-1,2)В; 4 — (— 1,05)В; 5 — (-1,25)В.

Активность и воспроизводимость характеристик полученных электродов оценивают как по скорости ферментативной реакции, так и величине тока, отвечающего превращению пероксида водорода, образующегося в результате последовательных реакций.

Реакции, протекающие в биферментной системе, могут быть представлены следующим образом:

Инвертаза, иммобилизованная во внешнем слое мембраны, осуществляет реакцию превращения сахарозы: инвертаза

Сахароза + H 0 — — - Фр ктоза + ы, -D-Глюкоза з 1395675 в результате мутаротации о -D-глюкоза

I превращается в P -D-глюкозу, которая является субстратом глюкозооксидазы.

Глюкозооксидаза, иммобилизованная во внутреннем слое мембраны, осуществляет окисление глюкозы с образовани5 ем пероксида водорода по реакции: глюкозооксндаза

$ -D-Глюкоза + Ог + НгО же препятствует образованию мембраны и адсорбции фермента.

Характеристики биферментных электродов, изготовленных по предлагаемому способу, сохраняются в течение месяца, что позволяет широко применять их для определения сахарозы в медикобиологических исследованиях.

Кроме того, в предлагаемом способе отсутствует стадия закрепления мембраны на электроде, поскольку иммобилизация и закрепление мембраны осуществляются в одну стадию.

Формула изобретения

Способ приготовления биферментного электрода для определения сахароэы, включающий иммобилизацию глюкоэооксидазы и инвертаэы в мембрану и закрепление мембраны на электроде, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения способа и улучшения качества электрода эа счет повышения воспроизводимости его характеристик, иммобилизацию ферментов и закрепление мембраны проводят одновременно, выдерживая электрод при потенциале (-1,1) — (-1,2) В последовательно в растворе акриламида и N N -бис-метиI» ленакриламида, содержащего глюкоэооксидазу, а затем в растворе поливинилового спирта, содержащего инвертазу, а полученную мембрану обрабатывают глутаровым альдегидом.

40

Ток, мкА/cM г при E=0,68

Ag/AgC1

ВоспроиэвоСуммарное время для приготовления мин

Активность на основа— т(о тенциал поляризадимость характеристик

s, ж нии данных спектральных измерений, А, у.е. ции электрода, В

-1,05 0,08 — 1,10 0,32

-l,15 0,34

20-25

10-12

10-11

5-6

5-6

5-6

Образующуюся Н О оценивают спектрофотометрически, добавляя в раствор 10 иодид калия, который окисляется пероксидом водорода с образованием К3з.

Количество образующего комплекса KJ определяют при длине волны 350 нм.Величина оптической плотности служит мерой ферментативной активности электрода. Электрохимически активность ферментного электрода оценивают по величине тока, измеренного при потенциале +0,6В (относительно хлорсеребря-20 ного электрода сравнения), отвечающего.восстановлению пероксида водорода и пропорционального концентрации сахарозы в растворе.

В таблице представлены данные по активности и воспроизводимости характеристик электродов, полученных по предлагаемому и известному способам.

Результаты, представленны в таблице, показывают, что электрод, изготав-ЗО ливаемый по предлагаемому способу, имеет более высокую активность и воспроизводимость. Способ проще и быстрее.

Снижение характеристик электрода при выходе за область предлагаемых потенциалов обусловлено тем, что при потенциале менее отрицательном, чем

-1,1 В полимерные мембраны вообще не образуются, а при потенциалах отрицательнее -1,2 B начинается интенсивное выделение водорода, которое такГлюконовая кислота + Н Ог

2 2

1395675

Продолжение таблицы

-1 20 0 32

-1,25 0,20

5-6

10-1 2

15-20

5-6

Без потенциала (прототип) 0,14

28-32

50-60

4Значения тока измерены через 1 мин после наложения потенциала на электрод в растворе сахарозы в концентрации

10 З М. Приведены средние значения токов для 10 независи" .мьх электродов.

ФФ

Воспроизводимость характеристик оценивали по формуле: г

8 = — — — - ср ° 100X рср

А, получена для 10 электродов данного типа.

Составитель В.Иуронец

Редактор Т.Лазоренко Техред Л.Сердюкова 1(орректор О.Кравцова

Заказ 2468/27 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

11.3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4