Способ количественного определения вирусов

 

. „„SU„„1394708 (51)5 С 12 О 1/00, G 01 Б 33!53 // // (С 12 Q 1/ОО, С 12 R 1 91) :(21) 4056682/13 (22) 15,04.86 (46) 30,12,91. Бюл. >1- 48 (71) Институт биохимии им. A.Í. Баха и ИГУ им. M,В. Ломоносова (72) Б.Б. Дзантиев, A.Н. Блинцов, И.В. Березин, Л.N. Егоров, В.А..Изумрудов, В.A. Кабанов, А.Ф. Бобкова, И.Г. Атабеков и А.Б. Зезин .(53) 616-07 (088.8 } (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИруСОВ (57) Изобретение относится к области биохимии вирусов, преимущественно иммунохимии вирусов, и мажет быть использовано в различных областях медицины, сельского хозяйства, конгроля окружа|ощей среды, для высокочувствительного экспресс-анализа широкого ряда вирусов. Кроме того, предлагаемый способ может быть использован э практике лабараторнь х исслеф (1„

СОЮЗ СОВЕТСНИХ 6 < -. ° социалистичесник

Ф, l " РЕСПУБЛИН I

° ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР по делдм изОБРетениЙ и Отнрытий дований в области биохимии и молекулярной биологии. Цель изобретения— упрощение способа. Сущность предлагаемого способа заключается в том, чта меченые антитела взаимодействуют непосредственно с определяемым вирусам в растворе. Образующийся комплекс антитело-вирус переводится в нерастворимое состояние последовательным добавлением полианиона и поликатиона. Образующийся полизлектролитный комплекс полианионполнкатион является осадителем комплекса вирус-паликатиоч. Концентрацию метки можно определить непос- . редственно в растворе или в образовавшемся поликамплексе после его растворения. Определяемая концентрация метки пропорциональна начальной концентрации определяемого вируса и служит характеристикой «го содержания в исследуемом раств,ре.

1394708

Изобретение относится к Области иммунохимии вирусов и может быть использовано в различных областях ме-, дицины сельского хозяйства для ВысО кочувствительного экспресс-анализа материала, содержащего вирусы, Пелью изобретения- является упрощени е способа.

Пример 1 Анализ х-вируса картофеля (ХВК) с использованием в качестве полиэлектролитов полиметакриловой кислоты (ПИАК) и поли-Нэтил-4-винил-пиридиний бромида (ПВП).

В качестве антител используют 15

g-глобулиновую фракцию кроличьей антисыворотки к ХВК. 1-глобулиновую фракцию сыворотки крови выделяют двух" кратным осаждепием 20Х-ным водным растВОрОм полиэтилен гли коля (1 1 . В ° 20

400-6000) с последующим диализом против.0„01 M К-фосфатного буфера (0,1 M БаС1) рН 7,4.

Перед использованием иммуноглобулины термостатируют при 56ОC в те;ение 30 мии. В качестве фермента используют пероксидаэу хрена (ПХ) с

RZ=2,8-3,О (производство НПО "Биохимреактив", r. Олайне, Латвийская

CCP) (ЕС 1.11.1.7). Коньюгат иммуно- 30 глобулинов с пероксидазой (АТ-ПХ) получают методом окисления углеводного компонента фермента периодатом натрия.

В качестве антигена используют высокоочищенный вирусный препарат

ХВК. Препаративное выделение очищенных экс рактов ХВК, его очистку и концентрирование проводят по стандартной методике, используя несколь- 40 . ко циклов дифференицального центрифугирования, Полиметакриловую кислоту (ПИАК) получают свободнорадикальной поли" мериэацией метакриловой кислоты с 45 последующим выделением из метанола фракции с ЙВ„(=200000-300000 добавлением ацетоуксусного эфира.

Поли-К"этил-. 4-винич-пиридиний бромид (ПВП) получают алкилированием поли"4-винилпиридина избытком бромистого этила при 60 С в тече" иие 30 ч с последующим высаживанием в эфир. В работе используют ПВП с

NB „40000- 100000. 55

Экстракты вирусов иэ растительного материала получают, растирая материал в фарфоровой ступке с добавлением 0,01 М K-фосфатного буфера (0,1 M NaC1), 0,17 тритон Х-100) рН 7,4 в соотношении 1:5 (растительная масса: объем буфера), Полученные эк стр акты о светляют цент рифугир ованием S мин при 8000 об/мин. После иентрифугирования надосадок подвергBICT дальнейшему осветлению встряхиванием с хлороформом (1/3 часть от объема экстракта) .в течение 3 мин с интенсивностью около 100 качаний в минуту. Далее, эмульсию центрифугнруют 5 мин при 8000 o6/Mèí. Исполь эуют водную фазу. В пробирку, содер" жащую О, 1 мл исследуемого образца (растительный сок, экстракт или очищенный препарат ХВК), добавляют

0,05 мл раствора коньюгата А7-ПХ (100 нг/мл по ПХ).в 0,01 M К. — фосфатном буфере (0,1 M ИаС1 0,1 тритон Х-100) рН 7,8 (ТФБ) . После чего последовательно добавляют по

0,025 мл раствора ПИАК (0,2 мг/мл) и ПВП (0,5 мг/мл) в том же буфере.

Осадок отделяют центрифугированием

5 мин при 7500 об./мин на центрифуге

YI-6R (BackmBII, Австрия), Осадок отмывают трижды по 0,25 мл ТФБ. Отмытый осадок растворяют в 0,05 M трисацетатном буфере (1 M NBC1 0,17. тритон Х-100) рН 7,8 в течение

1 мин при комнатной температуре. До-

1 бавля1от О, 15 мл субстратной смеси (о-фенилендиамин 0,53 мг/мл, 0,008

К О в 0,1 М К-цитратном буфере рН S,2), инкубируют 10 мин при комНВТНоН температуре, Реакцию останавливают, добавляя 0,1 мл 4 И Н ЯО и определяют оптическую плотность продукта ферментативной реакции при

490 нм. Пересчет оптической плотности продукта ферментативной реакции в концентрацию ХВК производят по калибровочному графику, полученному при измерении стандартного препарата ХВК, внесенного в сок здорового растения. Чувствительность метода—

8 нг/мл ХВК, время одного анализа

15 мин. Иетод дает возможность выявлять ХВК в проростках, листьях растений на различных стадиях вегетации, а также проводить контроль растений, оздоровленных методом культуры меристем,.

Hp и м.е р 2., Определение вируса гепатита В с использованием ПМАК н ПВП. К 0,1 мл исследуемого образ" ца (сыворотка нли очищенный препарат поверхностного антигена Вируса гепа3 1 39470 тита В) добавляют 0,05 мл раствора меченых ферментом антител (40 нг/мл по Ферменту) и ТФБ. инкубируют 5 мин при комнатной температуре и переме5 зявании. Затем последовательно добавляют по 0,025 мл раствора ПМЛК (0,2 мг/мл) и ПВП (0,5 мг/мл). Осадок отделяют центрифугированием 5 мин при 2500 об/мин. К 0,05 мл надосадка добавляют 0,15 мл субстратной смеси (о-фенилендиамнн 0,53 мг/мл, 0,008Х

Н О в 0,1 И К-цитратном буфере рН 5,2). Инкубируют 5 мин при комнатной температуре. Реакцию оста- 15 навливают, добавляя 0,1 мл 4МН<80 и определяют оптическую плотность продукта ферментативной реакции при

490 нм. Чувствительность метода.—

0,5 нг/мл вируса, время анализа - 20

15 мин.

По сравнению с разработанным на сегодняшний день медицинской диагностикой иммуноферментным твердофазным 25 методом анализа гепатита В, предлагаемый способ позволяет сократить время анализа с 5 ч до 15 мин при

4 двухкратной увеличении чувствительности детекцин, Экспресс- метод де-. текции вируса гепатита В представ" ляет большой интерес для применения на станциях переливания крови, где в настоящее время используется метод встречного иммуноэлектрофореза, позволяющий определить в течение суток до 1 мкг антигена °

Формула изобретения

Способ количественного определения вирусов, включающий образование комплекса исследуемых вирусов с мечеными специфическими антителами и осаждение! его под действием поликатиона и полианиона, отмывание осадка, добавление субстрата и определение концентрации вирусов по концентрации метки, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения способа, меченые антитела добавляют непосредственно к вирусам, а поликатион и полианион вводят последова» тельно к полученному комплексу вирусы-меченые антитела.

Составитель В. Дроздов

Редактор Н. Тимонина Техред M.Äèéûê Корректор Н. Король

Заказ 46 73/ДСП Тираж 31" Подпи сно е, ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород„ ул. Проектная, 4