Способ определения l-лизина

 

Изобретение относится к анадштической 6иoxи ии, а именно к анализу биологически активных соединений с помощью ферментов. Целью изобретения является повышение точности определения . Способ заключа ется в том, что при определении L-лизина производят его окисление Ь-лизин-2-моно- .окслгеназой продуцируемой штаммом Pseudomonas putida ВКМ В-1458. При этом по и:зменению концентрации кисло рода судят о количестве лизина. Изме-, рение концентрации кислорода проводят , например, мембранным кислородным электродом. Используемый фермент может быть любой степени очистки и использован как в растворе, так и р иммобилизованном состоянии. 3 табл.

СОВХОЗ СО ЕТСНИх

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

„.SU(„) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К Д ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (46) 30.08.90, Бюл. В 32. (21) 4 f 59529/30-13 (22) 05.08.86 (72) А.Л.Симонян, Г.Э.Хачатрян, С.Ш.Татикян и Ц.И.Авакян (53) 663.15(088.8) (56) Патент США И 4234691, кл. С 12 N 9/06, 1980.

T.Nakazava, K.Hori, О.Науаishy, Studies on Nonooxygenasås V. Х. of

Biol. Chem., 247„ 3439-3444, 1980. (54), СПОСОБ. ОПРЕДЕЛЕНИЯ Ь-ЛИЗИНА (57) Изобретение. относится к аналитической биохимии, а именно к анализу биологически активных соединений (51)5 С 12 P 13/08, С 12 Q 1/26 с помощью ферментов. Целью изобретения является повышение точности определения. Способ заключается s том, что при определении L-лизина производят его окисление Ь-лизин-2-моно:,.аксигеназой продуцируемой штаммом

Pseudomonas putida ВКМ В-1458. При, этом по вменению концентрации кислорода судят о количестве лизина. Изме-. рение концентрации кислорода проводят, например, мембранным кислородным электродом. Используемый фермент может быть любой степени очистки и использован как в растворе, так и р иммобилиэованном состоянии. 3 табл.

1387417

Изобретение относится к аналитической биохимии, а именно к анализу биологически активных соединений с . помощью ферментов. 5

Целью изобретения является ловышение точности определений.

Способ заключается в том, что при определении L-лизин окиспяется L-лизин-А -оксигеназой из Рзеийопопаа ри 10

tida - ВКИ В-1458.

При этом контроль ведут регистра-. цией убыли концентрации кислорода при ферментативной реакции окисления

L-лизина ферментом L-лизин-2-моно- 15 оксигеназой. . Измерение концентрации кислорода .проводят, например, мембранным .кислородным электродом.. Используемый фермент может быть любой степени 20 очистки, поскольку даже в клеточном гомогенате не содержатся ни другие оксидазы аминокислот, ни ингибиторы

L-лизин-2-монооксигеназы.

Процесс определения L-лизина проводят следующим образом. В герметичную, термостатируемую ячейку заливают буфер и перемешивают магнитной мешалкой." Ячейка снабжена кислород-. ным электродом. Оптимальный объем . 30 ячейки 3-10 мл. Большие объемы при-., Йодят к увеличению траты как фермента, так и анализируемого раствора, а слишком маленький объем ячейки снижает точность определения. В ячейку добавляют 0,05 мл ферментного раствора любой степени очистки или клеточный гомогенат, содержащий 1-8 МЕ ферментативной активности. После установления тока кислородного элект- рода в ячейку вводят 0,1 мл образца и регистрируют скорость потребления кислорода. На основе известных кон.. центраций строится калибровочная кривая, с помощью которой определяют концентрацию 1.-лизина в пробе.

При использовании иммобйлизованно-, го фермента его помещают в проточный реактор, через который с постоянной скоростью прокачивают буферный раствор. Скорость протока подбирается экспериментально, исходя из параметров колонки. На выходе колонки устанавливают кислородный электрод и ре-. гистрируют ток электрода. В проток " вводят 0,05 мл анализируемого раствора и регистрируют максимальное зна.чение амплитуды сигнала или его проиэводной. На основе кривой, полученОпределяемая аминокислота

Относительная активность, Х

Фермент после

Грубый клеточный фермент после хроматографии на сеф.

ДЭАЭ А-50 сульфатного осажэкстракт дения

100

100 100 а1 1

? -лизин

L-орнитин

0 0

L-аргинин

L-/3-фенипЫ,-алании

О

0 - О

О, О

1 -гистидии

L-глутамин

О 0

L-аспарагин ной с помощью известных концентраций, определяют содержание Ь-лизина в пробе.

Пример I. Для определения концентрации L-лизина в термостатируемую ячейку объемом 5 .мл, содержа щую 0,05 М глицин-ОН-буфера .рН 9,0, при 25 С вводят 0,05 мл ферментного раствора любой степени очистки, содержащего 3,5 ИЕ каталитической. активности. Концентрацию кислорода в ячейке определяют с помощью мембранного кислородного электрода, содержимое ячейки перемешивают с помощью магнитной мешалки.

После установления тока электрода в ячейку вводят О, 1 мл раствораL-лизина и регистрируют скорость потребления кислорода.

И р и м е .р 2. Определение прово-, дят, как в примере 1. В ячейку Вво» дят ферментный препарат различной степени очистки, после установлейия тока кислородного электрода s ячейку вводят 0 1 мл раствора различных аминокислот при концентрации 20 мИ.

В табл. 1 приведены данные.опреде.ления субстратной специфичности L-лизин-2-монооксигеназы на разных стадиях очистки фермента.

Таблица.1

28,9 .

7,6

66,3

8,0

8,8

78,3

93,7

Концентрация

Ь-лизина, мИ

Величина сигнала, кислородного электрода, мкА

100,0

10,0

96,1

5,5

0,3

1, 13

11,0

16,5

2,0

2,63

22,0

83,2

8,5

Пример 3. К 500 мг силикагеля . (средний размер пор 200 А, удельная поверхность 280 м /г, фракция 0,60,4 мм) предварительно модифицирован- 5 ного 3-амннопропилтриэтохсисиланом и активированного глутаровым диальдегидом, приливают 4 мл раствора L-лизин-2-монооксигенаэы в 0,05 И калийфосфатном буфере РН 8,0, содержащего 10

32 ИЕ каталитической активности, и инкубнруют на качалке при комнатной температуре в течение 2,5 ч.

Иммобилизованньм препаратом заполняют проточный реактор длиной 110 мм 15 и внутренним диаметром 4 мм, снабженный кислородным электродом, и регистрируют изменение содержания кислорода в протоке 0,05 И глицин-ОН буфера

РН 9,0, происходящее вследствие фер- 20 ментативного окисления введенного в проток L-лизина. Скорость протока равна 3,5 мл/мин ° Объем вводимой пробы 0,05 мл.

Определение концентрации L-лизина 25 в растворах с помощью иммобилизованного ферментного препарата:

Таким образом, зависимость величи. ны сигнала от концентрации L-лизина описывается коРРеляционной пРямой 45 L=(0y 143+0,006)х+(-0,45+0,095) с коэффициентом корреляции 0,994, следовательно, в области концентраций . 5,5 — 22 мМ величина сигнала находится в линейной зависимости от концеит50 рации L-лизина.

При концентрациях вьппе 22 мИ определение можно проводить, разбавляя исследуемый образец до тех значений концентраций, которые окажутся в линейном диапазоне определения. При концентрации лизина в образце нике

5,5 мИ точное определение можно проводить с помощью метода добавок Дпя этого, прибавляя к исследуемой пробе» строго определенные количества кристаллического лизина, добиваются таких значений величины сигнала кислородного электрода, которые находятся в пределах линейного диапазона. Зная количество добавляемого лизина, легко можно рассчитать истинную концентрацию в исследуемой пробе.

Пример 4. Определение проводят, как в примере 1. В ячейку заливают 0,05 М глицин-ОН буфер с разны-: ми РН. После установления тока элект" рода в ячейку вводят О, 1, мм 50 мИ раствора L-лизина.

Влияние РН буфера на активность нативного ферментного препарата:

РН буфера Относительная ак тивность, Х

10,5 90,4

Определение концентрации Е-лизина можно проводить в широком дипазо» не РН.

Пример 5. Иммобилизованиый препарат готовят, как в примере 3. .Через реактор прокачивают 0,05 И. гли-. цин-ОН-буфер, рН от 8,5 до 10,5. Концентрация L-лизина в растворе 11 мИ, объем вводимой пробы 0,05 мп.

Влияние РН буфера на активность нмкобилизованиого фермента:

РН буфера Относительная активность, Х

9,0 100,0

9,5 82,3

М

Оптимальное значение .рН равно 9,0.

Однако, поскольку при рН 8,5 и,9,5 активность иммобилиэованного ферментного препарата остается на достаточ1387417

Номер про бы культуральной жидкости

Базовый (электрофорез на бумаге) Предла- Газожндгаемый костная способ хроматография

Определяемая аминокислота

11редлагаемый способ

Прототип

16,5

17,5 20,0

16,5

18,2

22,5

100

100

L-лизин

16,0

17,0 23,7

Е-орнитин

L-арф инин

26э0 28э6

29,4

L-| -фенилА-алании

26,5

12,0

28,0

15,2.,6

35, 7

28,5

12,8

Не опреде лено

Ь-гистидин40

L-глут амин

Ь-аспарагин

0 кислородного электрода, мкА

1,20

10 .

20-50

1,13

1,05

60 но высоком уровне, определение концентрации Ь-лизина возможно во всем укаэанном диапазоне рН при условии сохранения данного значения рН (что обеспечивается высокой буферной емкостью раствора) в ходе определения.

Пример 6. Иммобилизованный фермейтный препарат готовят, как в примере 3. В проток вводят 0,05 мл 10 раствора соответствующей L-аминокислоты с концентрацией 11 мИ, регистрируют максимальное значение амплитуды сигнала кислородного электрода.

В табл. 2 дана субстратная специфичность иммобилизованной L ëèçèí-2монооксигеназы к различным аминокислотам . Т а б л и ц а 2

Относительная активХ

11редлагаемый способ определения обладает более высокой по сравнению 45 с прототипом избирательностью по отношению к L-лизину и может успешно применяться при определении L-лизина в сложных многокомпонентных растворах, в том числе в смесях амино- 50 кислот

Предлагаемый способ позволяет пс. крайней мере на порядок уменьшить ошибку, вызванную окислением других аминокислот. Это важно, например» . для успешного слежения эа ходом ферментации прн промышленном производстве L-лизина.

Пример 7. Иммобилиэованный ферментный препарат готовят, как в примере 3. В проток колонки вводят

0,05 мл разбавленной в 10 раэ культуральной жидкости, полученной при микробиологическом производстве Ь-лизина. На основе калибровочной кривой, полученной с помощью модельных растворов Ь-лизина, определяют.,концентрацию L-лизина в культуральной жид" кости.

В табл. 3 приведены данные определения концентрации L ëèýèíà в культуральной жидКости разными методами..

Таблица 3

Концентрация L-лизина, г/л

20,5 22,4 22,8

П P.H м е р 8 Иммобилиэованный ферментный .препарат готовят, как в примере 3.

Стабильность иммобилизованной

L-лизин-2-монооксигеназы во времени при концентрации лизина 1! мИ, в протоке 0,05 М глицин-ОН-буфер рН 9,0, 25 С:

Количество дней Величина сигнала работы

1387417 ное значение амплитуды сигнала кис- " лородного электрода, так и проиэвод ной сигнала, обеспечено запоминание максимальной амплитуды сигнала кислородного электрода. Осуществлена стыковка устройства с микроЭВМ, что позволяет производить. автоматическую обработку информации.

Формула изобретения

Составитель В.Варламов

Редактор Л,Волкова Техред А.Кравчук Корректор В.Гирняй

Тираж 48 1 . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35 Раушская наб., д. 4/5

Заказ 3091

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4"

Иммобилиэованный февментный препарат sa два месяца работы теряет не более 303 исходной активности.

Пример 9. Реализация предложенного способа определения L-лизина.

Предложенный способ реализован в виде устройства, представляющего . собой проточный реактор с иммобилизованным ферментом Ь-лизин-2-монооксигеназа из Pseudomonas putida

ВКМ В-1458, На выходе реактора установлена камера детектирования с кислородным электродом. 15

Конструкция камеры детектирования .позволяет осуществлять равномерную подачу раствора к кислородному электроду. Устройство ввода образца позволяет вводить в проток буферного раст-;ц) вора точно дозированные количества анализируемого образца. Электронный блок обеспечивает стабилизированное питание кислородного электрода, дает возможность определять как максималь- 25

Способ определения L-лизина, включаюший взаимодействие анализируемого образца, содержащего L-лизин, с ли« эинокисляющнм ферментом в буферном растворе с последующей регистрацией изменения концентрации кислорода и установлением по его величине количества лизина, о т л и ч а ю щ и Й— с я тем, что, с целью повышения точности определения, в качестве лизинокисляющего фермента используют L-ли зин-2-монооксигеназу, нродуцируемую

Peeudomonas: putida.ÂÊÌ В-1458.