Вакцина против оспы птиц и способ ее изготовления

 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности касается культуральной вакцины из аттенуированного штамма вируса оспы кур и способа ее изготовления. Целью изобретения является повышение иммуногенной активности вакцины против оспы птиц и упрощение способа ее изготовления. Вакцина имеет следующий состав, вируссодержащий материал из штамма "К" вируса оспы кур с биологической активностью вируса 7,0 7,5 lg ТЦД_50/мл или 4,0 4,5 lg ИД для птиц 65,0 70,0; пептон 5,7 7,0, лактоза 5,7 7,0, буфер фосфатный остальное. В вакцину добавляют антибиотики: пенициллин 100 200 ЕД/мл и стрептомицин 100 200 мкг/мл. Способ изготовления вакцины заключается в следующем: суспензию трипсинизированных клеток кожи эмбрионов кур заражают вирусом оспы кур (щтамм "К") и культивируют в течение 72 96 ч, после чего подвергают замораживанию оттаиванию. Полученный вируссодержащий материал с титром вируса 7,0 7,5 lg ТЦД_50/мл смешивают с 1 частью стабилизатора, расфасовывают в ампулы и лиофилизируют.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности касается культуральной вакцины из аттенуированноо штамма вируса оспы кур и способа ее изготовления. Цель изобретения повышение иммуногенной активности вакцины против оспы птиц и упрощение способа ее изготовления. Вакцину готовят из аттенуированного штамма "К" вируса оспы кур, репродуцированного в монослойной культуре клеток кожи куриного эмбриона. Предлагаемая вакцина против оспы птиц имеет следующий компонентный состав, Вируссодержащий материал из штамма "К" вируса оспы кур с биологической активностью вируса 7,0-7,5 lg ТЦД_50/мл или 4,0-4,5 lg ИД_50/мл для птицы 65,0-70,0 Пептон 5,7-7,0 Лактоза 5,7-7,0 Буфер фосфатный Остальное В вакцину добавляют антибиотики: пенициллин 100-200 Ед/мл и стрептомицин 100-200 мкг/мл. Защитная среда стабилизатор-имеет следующий состав, пептон 19-20, лактоза 19-20, фосфатно-буферный раствор до 100. Используемый в качестве вакцинного аттенуированный штамм "К" вируса оспы кур (virus Borreliota gallinarum) хранится в коллекции вирусов Всесоюзного ордена Трудового Красного Знамени государственного научно-контрольного института ветеринарных препаратов Госагропрома СССР, имеет регистрационный N 22 и характеризуется следующими признаками и свойствами: Морфологические признаки. При электронной микроскопии вируссодержащей культуральной суспензии выявлены вирионы характерной для вирусов оспы формы; посторонних вирусных контаминантов и микоплазм не обнаружено. Инфекционная активность. Титр вируса в культуре клеток кожи эмбриона кур составляет 7,5 lg ТЦД_50/мл на цыплятах при титровании методом "укола" в перепонку крыла 6,0 lg ИД _50/мл. Иммуногенная активность. Минимальная 50%-ная иммунизирующая доза для цыплят соответствует 2,18 lg ИД₅₀ при внутрикожном введении методом "укола" в перепонку крыла. Введение цыплятам вакцинного штамма вируса в дозе 10³-10⁴ ИД₅₀ полностью предохраняет всех цыплят от заражения вирулентным штаммом вируса оспы. У 100% цыплят, иммунизированных в дозе 1000 ИД_50/0,015, иммунитет наступает на 7 день. У 50% цыплят, иммунизированных в дозе 100 ИД_50/0,015, иммунитет наступает на 7 день, а 100% иммунитет формируется через 2 недели. Безвредность. Штамм "К" вируса оспы кур безвреден для цыплят при внутрикожном введении в дозе 5 х 10³ и 10⁴ ИД₅₀. Местная реакция, которая наблюдается у цыплят на месте введения вируса, к 28-30 дню полностью исчезает. Генерализации оспенного процесса ни в одном случае не установлено. Реверсибельность. Штамм "К" вируса оспы кур не обладает реверсибельными свойствами, что подтверждается проведением 10 последовательных пассажей на восприимчивых цыплятах путем внутрикожного введения вируса. У всех цыплят на месте введения вируса проявлялась местная реакция. Генерализации оспенного процесса после проведения 10 пассажей вируса на цыплятах не установлено. Таким образом, используемый в качестве вакцинного культуральный аттенуированный штамм "К" куриного вируса оспы, свободен от вирусных контаминантов и микоплазм, имеет высокую инфекционную и иммуногенную активность для цыплят, безвреден и не обладает реверсибельностью. Способ изготовления вакцины против оспы птиц заключается в следующем: суспензию трипсинизированных клеток кожи эмбриона кур (КЭК) при их концентрации 200-300 тыс.клеток для матрасов и 600-800 тыс. клеток для бутылей в 1 мл питательной среды 0,5% гидролизат лактальбумина (ГЛА) на растворе Хенкса, содержащий 2-2,5% сыворотки крови крупного рогатого скота или сыворотки крови оленей, заражают вирусом оспы кур (штамм "К") из расчета 0,05-0,5 ТЦД на клетку разливают в матрасы или бутыли и культивируют в стационарных условиях или роллерной установке при температуре 35,5-36,5^оС. Культивирование вируса проводят в течение 72-96 ч, после чего культуральную жидкость суспензию инфицированных клеток КЭК в питательной среде подвергают замораживанию при температуре минус 20-40^оС с последующим оттаиванием при температуре 30-37^оС. Полученный вируссодержащий материал из вируса оспы кур штамм "К" с титром 7,0-7,5 lg ТЦД_50/мл используют для изготовления предлагаемой вакцины против оспы птиц. В качестве стабилизатора применяют среду следующего состава: пептон 19-20% лактоза 19-20% фосфатный буфер, рН 7,0-7,4, до 100% При изготовлении вакцины 2 части (65-70%) вируссодержащей жидкости с титром вируса 7,0-7,5 lg ТЦД_50/мл смешивают с 1 частью (30-35%) стабилизатора, расфасовывают в ампулы по 2 мл и лиофилизируют. Полученная вакцина предназначена для профилактики оспы кур. Перед употреблением сухую вакцину разводят разбавителем, содержащим 25% глицерина в буферном растворе, и вводят птице в объеме 0,015 мл внутрикожно методом "укола" в перепонку крыла 2-игольным инъектором. Цыплят вакцинируют с 30-дневного возраста, через 2 месяца ревакцинируют. Птицу 2-месячного возраста и старше прививают однократно. Примеры изготовления вакцины против оспы кур из аттенуированного штамма "К" вируса оспы кур. П р и м е р 1. Подготовка культуры клеток. 10-12 куриных эмбрионов 12-дневного возраста трижды промывают раствором Хенкса (рН 7,2-7,4) с антибиотиками (100 ЕД пенициллина и 100 мкг канамицина на 1 мл раствора), заливают 0,2-0,25%-ным раствором трипсина, подогретого до 37^оС, и трипсинизируют в течение 7 минут при комнатной температуре. Жидкость сливают в центрифужные стаканы, а оставшиеся эмбрионы повторно заливают раствором трипсина и дополнительно трипсинизируют еще 3 мин. Сливы объединяют и взвесь клеток центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин. П р и м е р 2. Получение вакцины против оспы кур. Трипсинизированные клетки кожи эмбрионов кур после центрифугирования и культуральной аттенуированный штамм "К" вируса оспы кур внесли в 1 л питательной среды, содержащей 0,5% ГЛА на растворе Хенкса. Концентрация клеток 200 тыс. в 1 мл среды, множественность заражения 0,05 lg ТЦД₅₀ на клетку. К смеси добавили 20 мл сыворотки крови крупного рогатого скота и антибиотики. Зараженную вирусом суспензию разлили в матрасы. Культивирование проводили при температуре 35,5^оС. Через 72 ч после заражения суспензии при наличии цитопатогенного действия вируса монослой клеток со средой подвергли замораживанию при температуре минус 20^оС с последующим оттаиванием при температуре 30^оС. В результате получили 1000 мл вируссодержащей суспензии с титром вируса 7,0 lg ТЦД_50/мл. Для изготовления 1 л вакцины к 650 мл полученной вируссодержащей культуральной жидкости из штамма "К" вируса оспы кур с титром 7,0 lg ТЦД_50/мл добавили 350 мл подогретой защитной среды стабилизатора, растворы смешали и расфасовали в ампулы по 2 мл, затем лиофилизировали. Полученная вакцина имеет следующий компонентный состав, Вируссодержащий материал
из аттенуированного
штамма "К" вируса оспы кур 65,0 Пептон 6,65 Лактоза 7,0 Фосфатный буфер Остальное
П р и м е р 3. В 1 л питательной среды, содержащей 0,5% ГЛА на растворе Хенкса и 2,5% сыворотки крови оленей, внесли одновременно трипсинизированные клетки КЭК и культуральный штамм "К" вируса оспы кур из расчета 800 тыс. клеток на 1 мл среды и 0,5 lg ТЦД на клетку соответственно. Зараженную вирусом суспензию разлили в бутыли. Культивирование проводили в роллерной установке при температуре 36,5^оС в течение 96 ч, после чего вместе со средой клетки заморозили при температуре минус 40^оС, а затем оставили для оттаивания при 37^оС. После оттаивания получили 1000 мл вируссодержащей суспензии с титром вируса 7,5 lg ТЦД_50/мл. Для изготовления 1 л вакцины к 700 мл вируссодержащей культуральной жидкости из штамма "К" вируса оспы кур с титром 7,5 lg ТЦД_50/мл добавили 300 мл подогретой защитной среды (стабилизатор), состоящей из 20% пептона и 19% лактозы в калийфосфатно-буферном растворе; растворы смешали, расфасовали в ампулы по 2 мл и лиофилизировали. Полученная вакцина имеет следующий компонентный состав,
Вируссодержащий материал
из аттенуированного штамма "К" вируса оспы кур 70 Пептон 6,0 Лактоза 5,7 Фосфатный буфер Остальное
П р и м е р 4. В 1 л питательной среды, содержащей 0,5% ГЛА на растворе Хенкса и 2% сыворотки крови оленей, внесли одновременно трипсинизированные клетки КЭК из расчета 250 тыс. клеток на 1 мл среды и 0,1 lg ТЦД₅₀ штамма "К" вируса оспы кур на клетку. Зараженную вирусом суспензию разлили в матрасы. Культивирование проводили при температуре 36^оС в течение 90 ч, после чего вместе со средой клетки замораживали при температуре минус 30^оС, а затем оставили для оттаивания при 37,5^оС. После оттаивания получили 1000 мл вируссодержащей суспензии с титром вируса 7,3 lg ТЦД_50/мл. Для изготовления 1 л вакцины к 675 мл полученной вируссодержащей культуральной жидкости из штамма "К" вируса оспы кур с титром 7,3 lg ТЦД_50/мл и 325 мл подогретой защитной среды (стабилизатор), состоящей из 19,5% пептона и 19,5% лактозы в буферном растворе; растворы смешали, расфасовали в ампулы по 2 мл и лиофилизировали. Полученная вакцина имеет следующий компонентный состав,
Вируссодержащий материал
из аттенуированного штамма "К" вируса оспы кур 67,5 Пептон 6,1 Лактоза 6,5 Буфер Остальное
Режимы и условия, используемые при изготовлении предложенной вакцины, а также соотношения компонентов в составе пpепарата, являются оптимальными. Применение значений, выходящих за пределы указанных, приводит к ухудшению вакцины. Так, при получении вируссодержащей суспензии внесение в питательную среду клеток меньше 200 тыс на 1 мл и вируса 0,05 lg ТЦД₅₀ на клетку и культивирование вируса меньше 72 ч не обеспечивают достаточного накопления вируса, а применение суспензии с концентрацией клеток больше 300 тыс. на 1 мл, вируса 0,5 lg ТЦД₅₀ на клетку и культивирование вируса свыше 96 ч не приводит к улучшению результатов. П р и м е р 5. Контроль культуральной вакцины из штамма "К" вируса оспы кур на иммуногенность. Цыплят 90-дневного возраста вакцинировали однократно методом "укола" в перепонку крыла предложенной вакциной из штамма "К" вируса оспы кур в дозе 1000 и 10000 ИД_50/0,015 по 5 голов каждой дозой. Через 24 дня все вакцинированные и 5 контрольных (невакцинированных) цыплят были заражены внутрикожно (в другое крыло) методом "укола" в перепонку крыла вирулентным штаммом "Кучинский" вируса оспы кур в дозе 1000 ИД_50/0,015. Местную реакцию на введение вирулентного штамма вируса учитывали на 7 и 10 дни. Все 10 цыплят, вакцинированные в дозе 1000 и 10000 ИД_{50/0,015 мл} и зараженные контрольным штаммом в дозе 100 ИД₅₀, имели отрицательную реакцию на внутрикожное введение вирулентного вируса, т.е. оказались иммунными. У всех пяти контрольных цыплят отмечена яркая реакция (оспины и отек прилегающей ткани) на введение вирулентного вируса. П р и м е р 6. Определение ИмД₅₀ вакцины. Для определения минимальной иммунизирующей дозы вакцины цыплят прививали однократно методом "укола" в перепонку крыла культуральной вакциной из штамма "К" вируса оспы кур в дозе 1, 10, 100 и 1000 ИД_{50/0,015 мл} (каждой дозой по 8 цыплят). Через 24 дня цыплята были заражены в другое крыло вирулентным вирусом оспы кур (штамм "Кучинский"). Реакцию учитывали на 7 и 10 дни. Процент защиты цыплят от заражения в зависимости от дозы вакцины (ИД₅₀) составил: 1000 доз 100% 100 доз 90% 10 доза 60% 1 доза 45%
Расчет минимальной иммунизирующей дозы проведен по методу Рида и Менча. Установлено, что разведение вакцины 1:4571 (-3,66 lg) составляет одну иммунизирующую 50%-ную дозу, равную 2,18 lg ИД₅₀ при внутрикожном введении методом "укола" в перепонку крыла. Данные комиссионного испытания предлагаемой вакцины против оспы птиц из штамма "К" вируса оспы кур свидетельствуют о ее безвредности, активности и иммуногенности, а также отсутствии контаминации бактериальными и другими вирусными агентами и стабильности вакцинного штамма "К" куриного вируса оспы. Иммунитет у цыплят, однократно вакцинированных в 2-3-месячном возрасте, наступает на 7 сутки и проявляется в течение года. Для создания напряженного иммунитета у цыплят, вакцинированных в раннем возрасте, проводят их ревакцинацию через 2-3 месяца. Срок годности препарата не менее 1 года. Предложенная культуральная вакцина из вируса оспы кур, изготавливаемая в культуре клеток кожи куриного эмбриона, по сравнению с известными обладает более высокой инфекционной и иммуногенной активностью. Инфекционная активность вакцины составляет 7,0-7,5 lg ТЦД_50/мл или 4,0-4,5 lg ИД₅₀. Для создания иммунитета у 50% птиц минимальная концентрация вируса известной вакцины (прототип) составляет 104,0 ТЦД_50/мл, предлагаемой вакцины 103,84 ТЦД_50/мл, а в абсолютном выражении 10000 и 6918 ТЦД_50/мл соответственно. Предложен более простой, по сравнению с известными (прототип), способ получения вакцины против оспы птиц. В отличие от известного в предлагаемом способе для получения культуры КЭК используют целые эмбрионы без вырезания кусочков кожи. Кроме того, трипсинизированные клетки КЭК и вируссодержащий материал для заражения их вносят в питательную среду одновременно, а не в сформировавшийся заранее монослой клеток как в известном способе. В результате высокоактивную вирусную суспензию в культуре КЭК по предлагаемому способу получают за 3-4 дня, а по известному способу за 7-9 дней, при этом технология производства культуральной вакцины более экономична.

Формула изобретения

1. Вакцина против оспы птиц, включающая вируссодержащий материал из аттенуированного штамма вируса оспы птиц и стабилизатор, отличающаяся тем, что, с целью повышения иммуногенной активности вакцины, в качестве вируссодержащего материала она содержит вируссодержащий материал из штамма Borreliota gallinarum ВГНКИ N 22 с биологической активностью 7,0 7,5 lg ТЦД _50/мл или 4,0 4,5 lg ИД_50/мл, а в качестве стабилизатора используют смесь равных количеств пептона и лактозы в фосфатном буфере рН 7,0 7,4 при следующем соотношении компонентов, об. Вируссодержащий материал из штамма Borreliota gallinarum ВГНКИ N 22 с биологической активностью 7,0 7,5 lg ТЦД _50/мл или 4,0 4,5 lg ИД_50/мл 65,0 70,0
Пептон 5,7 7,0
Лактоза 5,7 7,0
Буфер фосфатный Остальное
2. Способ изготовления вакцины против оспы птиц, включающий культивирование клеток кожи эмбрионов кур в питательной среде, заражение их вирусом оспы кур, с последующей обработкой суспензии клеток, добавление стабилизатора, расфасовку и лиофилизацию, отличающийся тем, что, с целью повышения иммуногенной активности целевого продукта и упрощения способа, культивирование осуществляют на первично трипсинизированной суспензии клеток, вирус вводят одновременно с суспензией клеток, из вирусов используют штамм Borreliota gallinarum ВГНКИ N 22 в дозе 0,05 0,5 ТЦД на клетку, культивирование проводят при температуре 35,5 36,5^oС в течение 72 96 ч, обработку осуществляют путем замораживания при температуре минус 20 40^oС с последующим оттаиванием при температуре 30 37^oС, а в качестве стабилизатора используют смесь равных количеств пептона и лактозы в фосфатном буфере.