Фрагмент генома вируса оспы кур штамма "к", содержащий ген тимидинкиназы, рекомбинантные плазмидные днк ptk1fpv и ptk2fpv, содержащие эту последовательность, и рекомбинантная плазмидная днк pintfpv1, обладающая способностью интегрироваться в геном вируса оспы кур
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, ветеринарии и медицине. Путем амплификации и клонирования фрагмента генома вируса оспы кур отечественного штамма "К" получают последовательность ДНК, несущественную для репликации вируса и содержащую TK-ген. Используя полученную последовательность ДНК, с помощью генно-инженерных манипуляций получают рекомбинантные плазмиды pTK1FPV и pTK2FPV, содержащие 5'- и 3'-концевые части ТК-гена. При помощи этих и других вспомогательных плазмид получают плазмидный вектор pINTFPV1, способный интегрироваться в геном вируса кур. Полученное техническое решение может найти применение при получении генно-инженерных вакцин на основе вируса оспы кур, которые могут быть использованы в ветеринарии и медицине. 4 с.п. ф-лы, 5 ил.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, ветеринарии и медицине, и представляет собой: последовательность ДНК, несущественную для репликации вируса и содержащую ген тимидинкиназы (ТК-ген), из генома вируса оспы кур штамма "К", и имеющую первичную нуклеотидную последовательность, приведенную ниже; рекомбинантные плазмидные ДНК pTKlFPV и pTK2FPV, содержащие полученную последовательность ДНК; рекомбинантный плазмидный вектор pINTFPVl, обладающий способностью интегрироваться в геном вируса оспы кур.
Вирус оспы кур является представителем рода Avipoxvirus семейства Poxviridae. Оспа кур, заболевание вызываемое вирусом оспы кур, является высококонтагиозным заболеванием кур. Распространена болезнь повсеместно. Экономический ущерб заключается в резком и продолжительном снижении яйценоскости, вынужденном убое больных и переболевших птиц. Для специфической профилактики оспы кур используют живые вакцины двух типов, приготовленные из аттенуированных иммунногенных и ареактогенных штаммов гетерологичного вируса оспы голубей или вируса оспы кур [1]. Авипоксвирусы обладают многими свойствами, характерными для всех поксвирусов: геном состоит из линейной двухспиральной ДНК размером до 300 kb, репликация вируса происходит в цитоплазме инфицированных клеток, вирионы обладают неикосаэдрической морфологией [2]. В отличие от других поксвирусов авипоксвирусы обладают узким кругом хозяев: продуктивная инфекция происходит только в организме птиц или в культурах клеток, полученных из тканей птиц. Попытки получить продуктивную инфекцию авипоксвирусов в организме млекопитающих или в культурах клеток млекопитающих не увенчались успехом [3]. Из других свойств авипоксвирусов следует также отметить термоустойчивость и простоту наработки [1]. Стратегия получения рекомбинантных авипоксвирусов основана на подходе, хорошо зарекомендовавшего себя при получении рекомбинантных вирусов осповакцины. Суть данного подхода заключается в том, что на первом этапе конструируют гибридную плазмиду, содержащую гетерологичный ген, фланкированный последовательностями ДНК вируса осповакцины из несущественной области вирусного генома. Полученную плазмиду используют для введения в клетки, инфицированные вирусом осповакцины. За счет рекомбинации по областям гомологии происходит встройка чужеродной последовательности в геном вируса. Затем определенным образом в популяции вирусного потомства можно выявить гибридные вирусы [4]. Известно несколько районов в составе генома авипоксвирусов, пригодных для интеграции чужеродных генов: ген тимидинкиназы [5], район терминальных инвертированных повторов [6], район, гомологичный гену тимидинкиназы вируса осповакцины [7]. Самым распространенным способом отбора рекомбинантных авипоксвирусов является использование гена -галактозидазы E.coli, что позволяет быстро идентифицировать рекомбинанты, используя хромогенный субстрат. Одной из наиболее распространенных конструкций для плазмиды интеграции является конструкция, предложенная в работе [7]. Особенностью этой конструкции является наличие двух противоположно направленных промоторных элементов внутри фланкирующих последовательностей. Причем под контролем одного из промоторов находится ген -галактозидазы, что позволяет легко и быстро идентифицировать полученные вирусные рекомбинанты, а под контролем второго промотора находится исследуемый чужеродный ген. В конце 80-х годов начались работы по получению рекомбинантных авипоксвирусов. В первую очередь были получены рекомбинантные вирусы оспы кур, содержащие гены вирусов, представляющих интерес для птицеводства: вируса болезни Марека [8, 9], вируса болезни Ньюкастла [6], вируса болезни Гамборо [10] и др. В опытах на птицах полученные рекомбинанты показали хорошие иммуннопротективные свойства, сравнимые с действием имеющихся коммерческих вакцин. В работе [3] было проведено сравнение использования рекомбинантных и имеющихся коммерческих вакцин и сделан вывод, что наилучший эффект дает комбинированное использование обоих типов вакцин. В этой работе также сделан вывод о необходимости получения рекомбинантных вирусов оспы кур, содержащих в своем геноме гены двух и более вирусов, то есть прототипов поливалентных вакцин. Практически одновременно были начаты работы по получению рекомбинантных авипоксвирусов, содержащих в своем геноме гены вирусов, вызывающих заболевания у млекопитающих и человека. Были получены рекомбинантные вирусы оспы кур, содержащие в своем геноме гены вирусов бешенства и кори, показавшие хорошие протективные свойства в опытах на мышах и крысах [11 - 13]. В работе [14] было показано, что рекомбинанты, полученные на основе вируса оспы канареек, более эффективны в опытах на животных, чем аналогичные рекомбинанты, полученные на основе вируса оспы кур. Впоследствии все исследования по получению и изучению свойств рекомбинантных авипоксвирусов в экспериментах на млекопитающих проводятся с использованием вируса оспы канареек в качестве вирусного вектора. Из последних работ можно отметить работу, в которой показано успешное применение рекомбинантных авипоксвирусов при вакцинации против чумы плотоядных в опытах на собаках [15]. Представляют интерес работы, в которых сообщается об использовании рекомбинантных авипоксвирусов в иммуннотерапии бешенства [16], рака [17], СПИДа [18], а также в качестве продуцентов интерлейкина, интерферона, фактора некроза опухолей [19]. Этот краткий литературный обзор позволяет сделать вывод, что использование рекомбинантных авипоксвирусов может найти применение в птицеводстве, ветеринарии и медицине. В России до настоящего времени не проводились какие-либо исследования, связанные с получением и изучением рекомбинантных авипоксвирусов отечественных штаммов. Технической задачей изобретения является конструирование вирусного вектора интеграции на основе вируса оспы кур штамма "К", используемого в России для специфической профилактики оспы кур, с целью создания поливалентных вакцин для птицеводства, а также в ветеринарии и медицине в качестве эффективного эукариотеческого вектора. Поставленная задача решается путем амплифицирования и клонирования фрагмента генома вируса оспы кур штамма "К", несущественного для репликации вируса и содержащего ТК-ген, и конструирования на его основе плазмидного вектора, обладающего способностью интегрироваться в геном вируса оспы кур. Для этого: 1. Выделяют геномную ДНК из вируса оспы кур штамма "К". 2. Методом ПЦР получают последовательность ДНК, содержащую ТК-ген и несущественную для репликации вируса, используя специфические праймеры. 3. Используя полученную последовательность ДНК, с помощью генно-инженерных манипуляций получают рекомбинантные плазмиды pTKlFPV и pTK2FPV, содержащие полученную последовательность ДНК в виде двух примерно одинакового размера фрагментов, содержащих 5'- и 3'-концевые части ТК-гена с прилегающими участками генома вируса оспы кур. 4. Определяют первичную нуклеотидную последовательность полученной последовательности ДНК, используя плазмидные ДНК pTKlFPV и pTK2FPV. 5. Получают плазмидный вектор pINTFPVl при помощи генно-инженерных манипуляций, используя плазмиды pTKlFPV и pTK2FPV и другие вспомогательные плазмиды. 6. Проводят трансфекцию плазмидным вектором pINTFPVl культуры клеток фибробластов эмбрионов кур, зараженных вирусом оспы кур штамма "К". Используя хромогенный субстрат X-gal, из вирусной популяции выделяют рекомбинантные вирусы. Сущность предлагаемых объектов изобретения состоит в следующем: 1. Последовательность ДНК, несущественная для репликации вируса и содержащая ТК-ген, из генома вируса оспы кур штамма "К" имеет первичную нуклеотидную структуру, приведенную на фиг.3. Она получена из генома вируса оспы кур штамма "К" посредством генной амплификации с помощью полимеразной цепной реакции, в которой использовались 4 синтетических одигонуклеотида, обозначенные как ТК11, ТК12, ТК21, ТК22 и имеющие следующие последовательности: ТК11 - 5 AAGCTTCGCCACGTTATTCGAA - 3; ТК12 - 5 GCGTGAAATGCTATGTCGACG - 3; ТК21 - 5 ACTCGTTTAGAAATCGATGCGTC - 3; ТК22 - 5 GCCAAGTACGCGCGATAAAG - 3. Они представляют собой элемент новизны. Олигонуклеотиды ТК11, ТК12, ТК21 имеют в своем составе сайты рестрикции: HindIII, SalI, ClaI, которых нет в полученных фрагментах. Полученная последовательность ДНК для удобства получена в виде двух фрагментов, которые в дальнейшем будут использованы как фланкирующие последовательности при сборке плазмиды интеграции. 2. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTKlFPV, содержащая 3'-конец ТК-гена вируса оспы кур и характеризующаяся следующими признаками: имеет молекулярную массу 2,16 мегадальтон размером 3272 п.о.; содержит амплифицированный фрагмент размером 604 п.о., обработанный эндонуклеазами рестрикции HindIII и SaiI, и кодирующий N-концевую часть тимидинкиназы вируса оспы кур; содержит HindIII-SalI - фрагмент плазмидного вектора pUC-18, имеющего размер 2668 п.о.; содержит участок начала репликации;содержит ген устойчивости к ампициллину;
содержит уникальные сайты для эндонуклеаз рестрикции, имеющие следующие координаты: HindIII-400, SalI-1004, BamHI-1016, SmaI-1023, KpnI-1029, SacI-1037, EcoRI-1037. 3. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTK2FPV, содержащая 5'-конец ТК-гена вируса оспы кур и характеризующаяся следующими признаками:
имеет молекулярную массу 2,16 мегадальтон размером 3269 п.о.;
содержит амплифицированный фрагмент размером 780 п.о., обработанный эндонуклеазой рестрикции ClaI и кодирующий C-концевую часть тимидинкиназы вируса оспы кур;
содержит ClaI-SmaI фрагмент плазмиды pMTL-22 размером 2497 п.о.;
содержит участок начала репликации;
содержит ген устойчивости к ампициллину;
содержит уникальные сайты для эндонуклеаз рестрикции, имеющие следующие координаты: XhoI-177, Bg1II-181, ClaI-188, EcoRI-981, HindIII-990, PstI-1000, SalI-1006, BamHI-1019. 4. Рекомбинантая плазмидная ДНК pINTFPVl, обладающая способностью интегрироваться в геном вируса оспы кур и характеризующаяся следующими признаками:
имеет молекулярную массу 4,87 мегадальтон размером 7388 п.о.;
содержит HindIII-EcoRI фрагмент плазмиды pUC-18 размером 2635 п.о.;
содержит участок начала репликации;
содержит ген устойчивости к ампициллину;
содержит амплифицированный фрагмент размером 604 п.о., обработанный эндонуклеазами рестрикции HindIII и SalI и кодирующий N-концевую часть тимидинкиназы вируса оспы кур;
содержит амплифицированный фрагмент размером 780 п.о., обработанный эндонуклеазами рестрикции ClaI и кодирующий C-концевую часть тимидинкиназы вируса оспы кур;
содержит два SalI-BamHI фрагмента плазмиды pBRPZ размером 110 п.о., содержащих промотор 11К вируса осповакцины;
содержит BamHI-KpnI фрагмент плазмиды pUC-128 размером 66 п.о., включающий уникальные сайты для эндонуклеаз рестрикции, BamHI, SmaI, PstI, EcorI, HindIII, SalI, XhoI, ApaI, KpnI;
содержит BamHI-SalI фрагмент плазмиды pBRPZ размером 3000 п.о., включающий ген -галактозидазы E.coli, обладающий способностью экспрессировать -галактозидазу в составе генома вируса оспы кур;
содержит уникальные сайты для эндонуклеаз рестрикции, имеющие следующие координаты: BamHI-1113, SmaI-1121, Pst-1129, EcoRI-1131, HindIII-1143, SalI-1158, XhoI-1164, ApaI-1177, KpnI-2183. Таким образом, при помощи генно-инженерных манипуляций из генома вируса оспы кур штамма "К" получена последовательность ДНК, несущественная для репликации вируса и содержащая ТК-ген; определена первичная нуклеотидная структура полученной последовательности ДНК; получены рекомбинантные плазмиды pTKlFPV и pTK2FPV, содержащие полученную последовательность ДНК; сконструирован плазмидный вектор pTNTFPVl, обладающий способностью интегрироваться в геном вируса оспы кур. Полученное техническое решение может найти применение при получении генно-инженерных вакцин на основе вируса оспы кур, которые могут найти применение в ветеринарии и медицине. Фиг.1. Физическая карта рекомбинантной плазмиды pTKlFPV. Фиг.2. Физическая карта рекомбинантной плазмиды pTK2FPV. Фиг. 3. Первичная нуклеотидная структура полученной последовательности ДНК, содержащей ТК-ген и несущественной для репликации вируса, из генома вируса оспы кур штамма "К". Цветом выделен ТК-ген. Фиг.4. Схема сборки плазмидного вектора pINTFPVI. Фиг.5. Физическая карта рекомбинантного вектора pINTFPVI. Пример 1. Получение последовательности ДНК, несущественной для репликации вируса и содержащей ТК-ген, из вируса оспы кур штамма "К". В качестве вирусного вектора был выбран вирус оспы кур штамма "К", используемый в России для специфической вакцинации против вируса оспы кур. Штамм был получен из ВГНКИ Ветпрепаратов. Вирус нарабатывают, очищают по методике, описанной ранее в работе [21]. Вирусную ДНК выделяют по методике, описанной в работе [22]. Праймеры для проведения ПЦР рассчитывают по программе OLIGO [23] с учетом ранее опубликованных нуклеотидных последовательностей генов тимидинкиназы авипоксвирусов [2, 20]. Структуры праймеров приведены ниже:
ТК11 - 5 AAGCTTCGCCACGTTATTCGAA - 3;
TK12 - 5 GCGTGAAATGCTATGTCGACG - 3;
ТК21 - 5 ACTCGTTTAGAAATCGATGCGTC - 3;
ТК22 - 5 GCCAAGTACGCGCGATAAAG - 3. ПЦР проводят по стандартной методике [24]. Амплифицированный фрагмент, полученный при проведении ПЦР с праймерами ТК11 и ТК12, обрабатывают рестриктазами HindIII и SalI. Из полученного гидролизата выделяют в 4% полиакриламидном геле фрагмент длиной примерно 600 п.о., что совпадает с рассчитанной длиной амплифицированного фрагмента 604 п.о. Амплифицированный фрагмент, полученный при проведении ПЦР с праймерами ТК11 и ТК12, обрабатывают рестриктазой ClaI. Из полученного гидролиза выделяют в 4% полиакриламидном геле фрагмент длиной примерно 780 п.о., что совпадает с рассчитанной длиной 780 п. о. Полученные таким образом амплифицированные фрагменты далее были использованы для получения рекомбинантных плазмидных ДНК pTK1FPV и pTK2FPV. Пример 2. Получение рекомбинантных плазмидных ДНК pTKlFPV и pTK2FPV, содержащих полученную последовательность ДНК. 1. 10 мкг плазмидной ДНК pUC-18 обрабатывают рестриктазами HindIII и SalI по общепринятой методике [25]. Из полученного гидролизата выделяют векторный фрагмент размером 2680 п.о. в 4% полиакриламидном геле праймеров. Амплифицированный фрагмент длиной 604 п.о. и векторную часть плазмиды pUC-18 сшивают при помощи лигазной реакции в 20 мкл буфера для лигирования [25]. 10 мкл лигазной смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli JM-109 [25]. Трансформанты высевают на LВ-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина, 5 мкг/мл Х-gal, 5 мкг/мл IPTG. Из белых клонов выделяют плазмидную ДНК и анализируют рестрикционным анализом [25]. Рекомбинантная плазмидная ДНК, содержащая фрагмент нужной длины, будет обозначена как pTK1FPV и в дальнейшем будет использована для определения нуклеотидной последовательности полученного амплифицированного фрагмента и для сборки плазмиды интеграции. Физическая карта плазмиды pTKlFPV приведена на фиг.1. 2. 10 мкг плазмидной ДНК pMTL-22 [26] обрабатывают рестриктазами ClaI и SmaI. Из полученного гидролизата выделяют в 4% полиакриламидном геле векторный фрагмент размером 2497 п.о. 780 п.о. Амплифицированный фрагмент длиной 780 п.о. и векторную часть плазмиды pMTL-22 сшивают при помощи лигазной реакции в 20 мкл буфера для лигирования. 10 мкл лигазной смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli JM-109. Трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина, 5 мкг/мл X-gal, 5 мкг/мл IPTG. Из белых колоний выделяют плазмидную ДНК и анализируют рестрикционным анализом. Рекомбинантные клоны, содержащие фрагмент нужной длины, будут обозначены как pTK2FPV и в дальнейшем будут использованы для определения первичной структуры полученного амплифицированного фрагмента и для сборки плазмиды интеграции. Физическая карта плазмиды pTK2FPV приведена на фиг.2. Пример 3. Определение первичной нуклеотидной структуры полученной последовательности ДНК. Первичную нуклеотидную структуру полученной последовательности ДНК определяют по методу Максама-Гилберта [25]. Для секвенирования используют по 3 независимых клона. Полученная последовательность приведена на фиг.3. Сравнение полученной первичной структуры с опубликованными ранее показало, что полученная последовательность ДНК содержит ген тимидинкиназы вируса оспы кур, причем 5'-конец гена тимидинкиназы расположен в амплифицированноv фрагменте длиной 780 п.о., а 3'-конец гена - в амплифицированном фрагменте длиной 604 п.о. Пример 4. Получение плазмидного вектора интеграции pINTFPVl. Для получения плазмидного вектора pINTFPVI используют плазмиды pTKlFPV и pTK2FPV, а также вспомогательные плазмиды pBRPZ [27] и pUC-128. Все генно-инженерные манипуляции проводят аналогично, как описано в примере 2, и согласно общепринятым методикам [25]. Схема сборки плазмиды pINTFPVI приведена на фиг.4. Физическая карта плазмиды pINTFPVI - на фиг.5. Пример 5. Получение рекомбинантного вируса оспы кур, содержащего ген -галактозидазы E.coli. Плазмидной ДНК pINTFPVI трансфецируют культуру клеток фибробластов эмбрионов кур, зараженную вирусом оспы кур штамма "К". Трансфекцию и отбор клонов проводят по методике, описанной ранее [11]. Полученные рекомбинантные вирусные клоны обладают способностью окрашивать культуральную среду при добавлении хромогенных субстратов: X-gal, Y-gal и др. Наличие рекомбинантных клонов доказывает правильность сборки плазмиды интеграции, а также возможность использовать полученную плазмиду для конструирования рекомбинантов, содержащих целевые чужеродные гены.
Формула изобретения
РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9