Способ получения сорбентов для выделения липид-зависимых белков

 

Изобретение относится к химии полимеров и может быть использовано в хроматографической технике для выделения липид-зависимых белков.Изобретение позволяет простым и удобным способом за 1,5-2 ч получить сорбенты для выделения липид-зависимых белков , что достигается ковалентным связыванием полисахаридной арилсодержащей матрицы с ненасыщенным фосфолипидом в присутствии AlClo при молярном соотношении фосфолипида и хлорида алюминия 1:5-6 в течение 1,5-2 ч 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

PECIlY5 flHH (19) (И) Al (51) 4 В 01 7 20/26 С 08 F 8/02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21 ) 4091592/31-05 (22) 22,07,86 (46) 15.07.88. Бюл. 1(26 (71) Московский институт тонкой хи" мической технологии им. М.В.Ломоносова (72) Н.Б.Якунина, А.П.Каплун и В.И.Швец (53) 678.544.9 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

М 689200, кл. С 08 В 37/12, 1980.

Barsykov Ь.Ь, Dam С.W, Bergelson Ь.D., Miur)а G.I, Wirts К.W.À.

Biochim Biophys Actа, 1978, ч.513, рр ° 198-204, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТОВ ДЛЯ

ВЫДЕЛЕНИЯ ЛИПИД-ЗАВИСИМЫХ БЕЛКОВ (57) Изобретение относится к химии полимеров и может быть использовано в хроматографической технике для выделения липид-зависимых белков.Изобретение позволяет простым и удобным способом за 1,5-2 ч получить сорбенты для выделения липид-зависимых белков, что достигается ковалентным связыванием полисахаридной арилсодержащей матрицы с ненасыщенным фосфолипидом в присутствии А1С1 при мо3 лярном соотношении фосфолипида и хлорида алюминия 1;5-6 в течение

1,5-2 ч. 2 табл.

1409319

Изобретение относится к химии высокомолекулярных соединений, а именно к способу получения сорбентов для выделения липид-зависимых белков, и

5 может быть использовано в биотехнологии и хроматографической технике.

Цель изобретения упрощение технологии способа.

Пример 1. Получение сорбента с использованием яичного фосфатидилхолина, 2 мл водно-этанольного геля фенил-сефароэы Сl-4B обезвожинают промывкой ацетоном и переводят в .ухой дихлорэтан (1О мл). Добавляют 0,12 ммоль природного фосфатидилхолина в 1 мл сухого дихлорзтана.

Смесь перемешивают и инкубируют

1,5 ч, после чего добавляют O,GO ммоль беэводноro хлористого алюминия, Катализатор прибавляют небольшими порциями при перемешиванш» ° Реакцию проводят 1,5 ч при 18-20 С и интенсивном перемешивании, особенно первые

5-10 мин. Реакционную колбу защищают 25 от света, По истечении указанного времени к реакционной массе добавляют

I О мл водного ацетона. Смесь переносят на фильтр и промывают 30 мл водного ацетона для удаления катализатора, затем 20 мл ацетона, 30 мл хлороформа для удаления избытка фосфолипида, 10 мл ацетона, 50 мл 0,257-ного тритона Х-100 для удаления неспецифически связанного с сорбентом фосфо35 липида, а для удаления детергента промывают водой, Полученный сорбент анализируют на фосфор. Степень связывания яичного фосфатидилхолина с полимером составляет 1,3-1,8 мкмоль 40 лиганда/мл геля. Скорость протекания полученного сорбента по сравнению с исходной фенил-сефароэой не изменяется, для колонок 0,5х2,0 см составляет 12-15 мл/ч.

Данные по примерам 2-20, контрольным примерам 21-23 и сравнительному примеру 24 приведены в табл.1.

Пример 25. Выделение фосфолипазы А яда осы. Навеску (4мг) лиофилиэированного яда осы растворяют в 1 мл 0,05 M трис-НС1 буфера, рН

7,5, содержащего 0,01 M и 0,2 M NaC1 (буфер I), и наносят на колонку 70 х х 0,55 мм с 2 мл полученного сорбента, содержащего 1,8 мкмоль липидного фосфора/мл геля, уравновешенного тем же буфером Ie Белок инкубируют с сорбентом 4 ч при 4 С. Баластные о белки удаляют промыванием колонки буфером I (30 мл). Фермент злюируют с колонки в отсутствие ионов Са буфером II (0,05М трис-НС1, рН 7,5, 0,05М

ЭДТА, 0,02M NaCI), содержащим O,OIЖ тритона Х-100 (19 мл), При последуюmeM увеличении содержания тритона

Х-100 до 0,17. в буфере для злюирования не наблюдают выхода с колонки белка и фосфолипазной активности.Скорость элюирования 12-15 мл/ч, температура 4 С.

Фосфолипаэную активность измеряют методом потенциометрического титрования при постоянном рН. В качестве субстрата используют яичный лецитин.

Реакцию проводят в термостатированной ячейке PH-стата при 37 С и рН

7,5. Реакционная смесь состоит иэ

2 мл O 01 М тритона Х-IОО, содержащего 0,01 М СаС1 и 0,05-0,1 мл

0105М этанольного раствора субстрата.

Добавляя к реакционной смеси 0,05

0,1 мл ферментного раствора, регистрируют объем титранта (О,OIM NaOH), прошедшего на поддержание постоянного pH в первые 10-15 с.

Белок контролируют спектрофотометрически по поглощению при 280 нм и по методу Лоури. Результаты по очистке фосфолипазы А из ядов осы и большого шершня приведены в табл.2.

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

Способ получения сорбентов для выделения липид-зависимых белков путем ковалентного связывания полисахаридной матрицы с ненасыщенным фосфолипидом, отличающийся тем, что, с целью упрощения технологии, суспенэию арилсодержащего сшитого полимера обрабатывают раствором фосфолипида, затем избытком хлорида алюминия в течение 1,5-2,0 ч при мо" лярном соотношении фосфолипида и хлорида алюминия 1:5-6.

1409319

Таблица 1

Условии полученил сорбектов а) Tsm фосфолипид оляр оотн

BITcNL сея9ьп йнияр

МОЛЬ ЛИГВНДd/ИЛ ГЕЛЯ ие

К ° с айкие Среднее 4 ачения опытов

l Фосфаткдилхолин аичиый

0,12

0,60

1:S 1 ° S

l ° 0

2,0

0,5-0,7 0,60+ 0,)0

0,48

1:4 1,5

l,40-+ 0,10

1:6

193-19S

1:7

0,4-0,5 0,45т 0,5

),0 0,3-0,4 0 35 0 05

7r Фосфвткднлэта- О, ) 2 О, 60 коланкк кичнмй

):5

1 ° 5 1 2-)4 1,30«+ 010

2,0 0,8-1,0 0,90 0,1 0

I:4 1 ° 5 0,3-0,4 О 35 0 05

0,48

° 6

1,2-1,3

0,72

l,25 t 0,05

0 2

0,84

):7

0,2

l2r

1:5 I 0 0,3-0,4 0,35+ 0,05

0,60

)3к Фосфатидилсерик 0,12 из моэГб крупно

Го роГбтоГО скота! ° S I 2-I ° 5 I 35 015

1 5

0,)2 0,60

2 ° О 0,9-),0 0 95 0,05

0,3-0,4 0,35 + 0,05

1,5

0,48

0,72

l в2-1 ° 3 ) ° 25- Ое05

0,2 . 0,2

1:6

l8r

I:7

0,84

I:5 ) ° 5 7,2-8,4 7,&0 t 0,60

l9 Фосфвткдюыопкк 0,24 ° 20 аичнмй

20 0,19 0,95

5 ° 5-6,4 5,95+ 0,45

0,3 О ° 3

0,06 0,30

2)к

0 40 2 00

22аBr

l0,О-13,О l1,50 i I 50

012 060 I 5 25 12)4 I 30ò 010

В прина ра личес фосфо лида „ ннолв

0,72

0,84

1,3-) 8

0,4-0,5 !,О-I 1

1,55- 0,25

0,45+ 0,05

),05 и 0,05

1409319

Продолжение табл.1

Время ре акции, час

Количест

Молярное соотноше ние фосфолипнда епень связыяання, моль лиганда/мл геля

Ткп фосфолнпнд оличест о фосфо нпида, миоль во хлори да арми кия ммел пркмера айкие Среднее 4 ачення опытов

0,08

28 1,2-2,5

24 н сравнительный по про уотфйВу загрузки а результаты s apswspax 1-24 приведены для

2 мл суспензии полимера;

- происходит разрушение гелеврй структуры полимера;

««-е - в качества полимера используется АН-сефароза 4В, в качестве лиганда - окислениый яичный фосфатидклхолин, приведено суммрное время про4есса иммобилизации, состоящего из стадий: окисление яичного фосфатидилхолина - 2 ч, связывание фосфолипида с полюаером - 24 ч, блокирование непрореагировавших аминогрупп полимера2 ч.

Таблица 2 и р и и е ч б я и ае.е, Исходные яды, фракции

Белок, мг

Активность

Выход, Х

Степень

Емкость, мг/мл очистки, раэ

Общая, Удельед ная,ед/мг Пред- Исходный яд осы ла400

100

I00

Фракция фосфолипаэы Аа после биоспецифической хроматографии

ree" мый

0,24 360

1500

15 3,0

Исходный яд большого шершня

Иэ

18 6480

360

100 вест" ный

Фракция фосфолипаэы Аа после биоспецйфической хроматографии

2,08 3912

1880

52 2,9

Составитель ll.×óïîâà

Техред Л. Сердюков ва

Корректор Л.Пилипенко

Редактор И.Касарда

Заказ 3420/9

Тираж 519

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4