Способ получения полимерных гидрофильных носителей для хроматографии

 

Изобретение относится к области. химии полимеров и может быть использовано для разделения высокомолекулярных соединений с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Изобретение позволяет получать полимерные гидрофильные носители для хроматографии , обладающие прочностью до давления 30 Мра, низкой неспецифической сорбцией (% элюции с носителя 97-100%) и высокой разрещающей способностью простым и быстрым способом (отсутстстадия обработки щелочью, а время синтеза сокращено до 5 ч), что достигается использованием для суспензионной сополимеризации f- глицидилметакрилата и пентаэритритолдимет акриг. лата в качестве органического растворителя для сомономеров смеси изаамилового спирта,н-бутанола и додекано- , ла,взятых в массовом соотношении

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (59 4 В 01 J 20/26

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИИ И ОТКРЫТИЙ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4169364/23-05 (22) 29 ° 12 86 (46) 30.05,88.Бюл. Р 20 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт особо чистых био." препаратов (72) Л.П.Гаврюченкова, С.М.Морозов, А.Г.Болдыревр Л.Н.Цуканова, В.В.Хонстантинов, С.Ф.Белая и В.А.Пасечник (53) 678.631 (088.8)

{56) Авторское свидетельство СССР

Р 1061828, кл. В 01 J 20/22, 1984.

Насоло Н. Recent progress in

gel-packing materials and detecс опа

fox modern liqnid chromatography in

Japan. — I.Chromatogr, 1985, v.322, р.227-236.

Патент CIllA 11 4256843, кл. С 08 J 9/36, опублик. 1979. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРНЫХ

ГИДРОФИЛЬНЬ1Х НОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ ХРОМАТО»

ГРАФИИ (57) Изобретение относится к области химии полимеров и может быть использовано для разделения высокомолекуляр, SU 1398902 А1 ных соддинений с помощью высокоэффекI тивной жидкостной хроматографии.

Изобретение позволяет получать полимерные гидрофильные носители для хроматографии, обладающие прочностью до давления 30 Мра, низкой неспецифической сорбцией (7 злюции с носителя 97-100 ) и высокой разрешающей способностью . простым и быстрым способом (отсутствует стадия обработки щелочью, а время синтеза сокращено до 5 ч), что достигается использованием для суспензионной сополимеризации глицидилметакрилата и пентаэритритолдиметакрир», лата в качестве органического растворителя для сомономеров смеси изоами - д лового спирта,н-бутанола и додекано-,ла,взятых в массовом соотношении (30-35):1,5 :(1-6) или смеси иэоамилового спирта, монохлорбензо-. с ла и циклогексанола, взятых в массовом соотношении (1,5-10)

:(2,5-30):(1-30), а также использованием в качестве гидроксилсодержащего соединения моноэпоксиэфира сорбита или гомополисахарида. 3 табл., 4 ил.

1398902

10

Изобретение относится к химии по лимеров, а именно к способу получения полимерных гидрофильных носителей для хроматографии, и может быть использовано н высокоэффективной жидкостной хроматографии для разделения природных и синтетических.,полимеров по молекулярным массам (N.Ì), Цель изобретения — повышение разрешающей способности носителей, 15 мас.ч.глицидилметакрилата (ГМА) 20

О

И си,= с- с- о- сн,-сн — сн, О 25

ЕН3! и 1 мас.ч. динитрила аэоизомасляной кислоты (ДАК) н смеси органических растворителей, состоящей из 70 мас.ч. 30 изоамилового спирта, 3 мас.ч. н-бутанола и 2 мас.ч. дадеканола (массовое соотношение 35:1,5:1) . Полимеризацию проводят в токе аргона при 70 С н течение 16 ч. Гранулы носителя отфильт- 35, ровывают на стеклянном фильтре, промывают 5 раз горячей водой и этанолом и фракционируют на ситах, выделяя фракции 5-10, 20-50 и 50-70 мкм.

Носитель содержит 16Х оксирановых 40 циклов, представляет собой белые сферические гранулы. 100 мас.ч. носителя помещают в термостатируемый реактор, снабженный механической мешалкой, выливают 200 мас.ч, водного 45 раствора, содержащего 50 ч,эпоксиэфира сорбита, поднимают температуру до 80 С и рН до 13 введением концентрированного раствора,.щелочи и перемешивают, н течение 5 ч. Далее ре, акционную смесь охлаждают до комнатной температуры, отфильтровывают гранулы носителя и отмывают водой до нейтрального значения рН. Гранулы носителя хранят н 60%-ном этаноле н закрытых флаконах или с включением антисептика (азида натрия) в количестве 0,02%. Гидрофилиронанный носитель (Солоза Н -40) имеет область снижение их неспецифической сорбции и упрощение процесса.

П р и м е- р 1 . В трехгорлый термостатируемый реактор, снабженный механической мешалкой, помещают раствор 15 мас.ч, поливинилпирролидона (M.М. 350000) в 400 мас.ч. дистиллиронанной воды, при перемешивании вводят раствор, состоящий из 15 мас.ч, пентазритритолдиметакрилата (ПЭДМ) .

1 фракционирования декстранов 10010000 дальтон (д.), Носитель выдерживает давление до 30 Мра.

Пример 2. Все операции проводят по примеру 1, используя ддя гидрофилизации носителя 200 мас.ч. водного растнора, содержащего 50 мас.ч. гомополисахарида с М.М. 10000, Пример 3. Все операции прово" дят по примеру 1, но в качестве растворителя для мономерон..используют систему: 50 мас.ч. иэоамилового спирта 3 мас.ч. н-бутанола и 12 мас.ч. додеканола (массовое соотношение

30:1,5:6) . Область фракционирования декстранов для носителя (Солона

Н -50) составляет 100-20900д.

Пример 4. Все операции проводят по примеру 1, но в качестве поверхностно-активного вещества используют поливиниловый спирт (М.М.

15000),содержащий 10-12Х неомыленных ацетатных групп, а растворение мономеров и инициатора проводят в смеси 60 мас.ч. циклогексанола, 10 мас.ч. изоамилового спирта и

5 мас.ч. монохлорбенэола (массовое соотношение 5:2>5:3,0). Область фракционирования декстранов для носителя (Солоза Н -55) составляет 1000200000 д.

Пример 5. Все операции проводят по примеру 3, но в качестве растворителя для мономерон используют систему из 40 мас.ч. циклогексанола, 20 мас.ч. изоамилового спирта и

15 мас.ч. монохлорбенэола (массоное соотношение (10:7,5:20) . Область фракционирования декстранов для носи1398902 теля (Солоэа Н -60) составляет

1000-300000 д.

Пример 6. Все операции проводят по примеру 3 но в качестве расЭ

5 ворителя для мономеров и инициатора используют смесь 30 мас.ч. циклогексанола, 10 мас.ч. изоамилового спирта и 35 мас.ч. моноклорбензола (массовое соотношение 5:17,5 :15) . Область фракционирования декстранов для носителя (Солоэа Н -65) составляет 10000-1000000 д.

Пример 7. Все операции проводят по примеру 3, но в качестве раст- 15 ворителя; для мономеров и инициато-. ра используют систему: 2,5 мас.ч.. циклогексанола, 3 мас.ч. изоамилового спирта, 70 мас.ч. монохлорбензола (массовое соотношение 1,5:35;1). Об- 20 ласть фракционирования декстранов для носителя (Солоза Н -75 ) составляет 100000-40х10

В табл.l -3 приводятся данные по элюции носителями белков, структуре 25 носителей и их физико-химические свойства. г

Условия проведения экспериментов по декстрановой порометрии одинаковы для всех носителей: колонка 10,0х дО х0,9 см; элюент — дистиллированная вода; скорость подвижной фазы 0,30,4 мл/мин; количество вводимой пробы

50-100 мкл; концентрация декстранов в пробе 0,17. или 1 мл/г; де е тор — 35 проточный рефрактометр; температура

20 С; диаметр гранул носителя 5070 мкм.

На фиг.1-4 приводятся зависимости, характеризующие работу носителей, 40 калибровочные кривые элюции белков носителями и хроматограммы разделения белков на носителях.

График кривых на фиг,l показывает зависимость коэффициента распре- - 45 деления (К 1) от логарифма молекулярной массы (1g Мщ) декстранов для носителей Солоэа Н(и TSK-HM, где (кривые 1-5) — Солоза Н -40; 50;

55; 60; 65 соответственно; (° кривые 3-5) — TSK HW-55; 60; 65 соответственно; (кривая 6) — носитель полученный при использовании циклогексанола для растворения мономеров и инициатора. 55

На фиг ° 2 и 3 показаны калибровочные кривые элюции белков с носителей

Солоэа Н -60 н TSK-HM-50 соответствейно.

Условия олюции: колонка 0,9 х х 27,7 см; элюент — фосфатный буфер, рН 6,6, 0,1 КСЕ; скорость подвижной фазы 23,3 мл/ч.сМ ; детектор — UV 280;:;

206 нм; зернение геля 30-60 мкм.

На фиг.4 показаны хроматограммы разделения смесей белков на носителе Солоэа Н -60: а. 1 — голубой декстран,2:ферритин,3 -1 -глобулин;

4 — P -лактоглобулин,5 — цитохром С; б.l — ферритин (примесь),2 — ферритин, 3 — p- -лактоглобулин, 4 - рибонуклеаза; в. I — голубой декстран, 2—

1 -глобулин, 3 — P 4лактоглобулин,.

4 — цитохром С, 4 — фрагмент цитохрома С.

Условия разделения: колонка l 5 х х 37 см; элюент — 1/30 М фосфатный буфер, рН 7,0 + 0,2 М KCf; скорость

0,6 мл/мин; температура 20 С детектор — UV 280 нм.

Формула изобретения

Способ получения полимерных гидрофильных носителей для хроматографии путем радикальной водно-суспензионной сополимериэации раствора соли глицидилметакрилата, пентаэритритолдиметакрилата и инициатора в органическом растворителе в присутствии водорастворимого стабилизатора суспензии и последующей обработки суспензия сополимера гидроксилсодержащим соединением, отличающийся тем, что, с целью повышения разрешающей способности носителей, снижения их неспецифической сорбции и упрощения процесса, в качестве органического, растворителя используют смесь изоами». лового спирта, н-бутанола и додеканола в массовом соотношении (30-35):

:1,5:(1-6) или смесь изоамилового спирта, монохлорбенэола и циклогексанола в массовом соотношении (1,510):(2,5-35,0):(1-30), а в качестве гидроксилсодержащего соединения — мо. ноэпоксиэфир сорбита или гомополисахарида.

1398902

Т а б л и ц а 1

Элюция белков с носителя Солоза Ну-55 и прототипа

Элюируемый белок

l6Ох1О

67хl о

98

35xl 0

100

100

100

99

17800

99

12000

Т а б л и ц а 2

Данные, по параметрам структуры носителей Солоза

Н и Т8К-Нч апазон молекулярнь разделяемых компо

Протеины

100 - 10. 10 50

Солоза Hat-40

Прототип TSK-HW

100 — 8 10 гоо - г 1о

Солоэа Hg-50

60 3

Прототип TSK-1%-50

5 ° 10 -810 т 4

500 — 2 10

Солоза H)-55

l ° 10 — 6 -10

1 "10 - 2 10 130

1,6

Прототип TSK-HW-55

1 10 — 7 10

Ъ . 5

1,9

2 10 - 9 10

Прототип

Солоза Н "60

TSK-HW-60

Солоза Н -65

510-110

310-3 ° 10

4 6

1,30

Прототип TSK-HW-65

I-1О - 1 10 290

4 а

5 10 — 5 ° 10

4 6

1,85

4 10 — 9 10 1 10 - 4-10

5 т 5 т

7 Солоэа Н -75

Прототип ТЯК-HW-75

5 7

I ° 10 - 1.10

5.10 - 5 10

f -Глобулин

Альбумин -Лактоглобулин

Миоглобин

Цитохром С

100-2 10

100 — 1,5 10

100 - 6 10

1 10 — 2 10 125

3 5 з r

l "10 - 3 10 230

2 10 - 3.10 230

I 10 1 10 250

1398902

Т а б л и ц а 3

Физико-химические свойства предлагаемых и известных носителей

Удельная

Носитель ного геля, м /см

5 Солоза H) -60

86,2

1,46

1,5

l l5

ПротоASK-m-60

2,0

1,46

140

58,5

1,4

1,46

6 Солоза HE-65

Прототип TSK-HW-65

1,47

1,4

32,1

Истинная плотность, г/см поверхность сухого геля, M /г

Удельная поверхность влажКоэффициент набухания в

Н О/г сухого геля

1398902 г.о Ф иман ИО 0008

Vg ню

6 8

Фий 2

t. Ю д цщин Я0000д щфеааза 180 000а ийунин бычий 67.ЯО д

Яяьбцнин яичнми Е 000 д не@юрипсинееен 2$000! ниоелойин 17300 Ф аяобуеин 1а00И

Яльоунин Вьчид 870008

Яиьбцний яичный 4% 000 8

Хинотриисиноьен ЩЯОф

Ииоыооин 17000 д

1398902

Составитель В.Чупов

Техред Д.Олийнык Корректор А Обручар

Редактор И.Петрова

Заказ 2618/7 Тираж 519 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская йаб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная; 4