Способ получения лейкоцитарных интерферонов человека

 

Изобретение относится к технологии рекомбинантных ДНК, т.е. к способам , использующимся в рекомбинантной ДНК-технологии, и к продуктам, полученным этими способами. Штамм бактерий Escherichia coli трансформируют рекомбинантами из группы pI,eIFiA25, pLelF В trp 7, pLelF С trp 35, pLelF D trp 11, pLelF FF trp 1, pLelF I trp 1 и pLelF j trp 1, далее культивируют трансформанты, выделяют и очищают лейкоцитарный интерферон.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

А3

„,Я0 „„141431 (Ю 4 С 12 N 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПЯ ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3302642/30"13 (22) 30.06.81 (31) 164986; 184909; 205578; 256204 (32) 01.07.80; 08.09.80; 10.11.80;

21 ° 04.81 (33) US (46) 30.07.88. Бюл. Р 28 (71) Ф.Хорфманн-Ля Рош унд Ко, АГ (СН) и Генентех, Инк. (US) (72) Девид Фан Нормен Геддель и Сидней Пестка (US) (53) 616.084 (088.8) (56) Shigekazu N. et al. Synthensin

Е. coli of à polypeptide with human

leukocyte interfегоn activity. Nature, ч. 284 March, 1980, р. 316-320. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ JIEAKOIlHTAPHbK

ИНТЕРФЕРОНОВ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к технологии рекомбинантных ДНК, т.е. к способам, использующимся в рекомбинантной

ДНК-технологии, и к продуктам, полученным этими способами. Штамм бактерий Fscherichia coli трансформируют рекомбинантами из группы pLe IFi A 25, pLeIF В trp 7, pLeIF С trp 35, pLeIF D trp 11, pLeIF FF trp 1, pLeIF I trp 1 и pLeIF j trp 1, далее культивируют трансформанты, выделяют и очищают лейкоцитарный интерферон.

1414319

Изобретение относится к области технологии рекомбинантных ДНК, т.е„ к способам, и".пользующимся в pe;:омбинантнсй 7(HK "òexíoëoãèè, и к продуктам» полученным этими способами.

Пример„ Иепользуют два микроорганизма: Г,„.со1х х177б и Е.ссорь

K-12 штамм 294 (конец A.ihi, Ьзг

Ъa-ã „) мР11К лейкоцитарного интерферона человека (Lell) получают из лейкопитсл »елсвека, взятых у. больных хро-. нической миелсг нной лейкемией. Таковь.ьм яьляются линия клеток обозначенная К(-1, полученных от пациентов с .острой миелогенной лейкемией.

У КС-1 клеток индуцируют продукцию лейкоцитарного интерферона мРНК помощью вирусов Сендай или Ньюкастла, Клетки собирают 5 ч спустя после индуцирования и РНК приготовляют пс методике с применением гуанидинтиоцианат-гуанидингидрохлорида.

Для получения 12 S фракций поли (А) мРНК используют олигодеокситимидин с» Т.-целлюлозную хроматографию и сахарсзное градиентное ультрацентрифугнсовапие.

5 мкг мРНК используют для полу( чения,цвойной цепочки кДНК по цепочечной мет6дике» Указанные кДНК фракцйо. :чр -ют по размерам с помощью электрсфореза на 6%-ном полиакриламидном геле и 230 нг материала с размерами в интервале от з00 »до 1500 в,rt. выделяют электроэлюированием. 100 нг этсй кДНК присоединяют к деоксицитидиновым остаткам (Йс) и реденатурируют с 470 нг плазмид рН R322, которые были соединень» с десксигуанозиновыми (с1С) остатками по (Рзь Х) сайту и используют для трансформации Е.со1 . х1776. Получают устойчивые к тетрациклину, чувствительные к ампициллину трансформанты. Синтезируют четыре набора дезоксиолигонуклеотидных зондов для каждой последовательности, содержащие три (Т-IA В, С, D) или один (Т-13А, В, С> 0) олигонуклеотид кажная. мРНК получают из 12 S PHY., КС-I инд1 цирсванных вирусом Сендай либо целиком полк (A) мРНК из неиндуциЪ2 рсванных леикоцитов. P-меченные кДНК готовят известным способом. Немеченный продукт выделяют с помощью гельфильтрации на к(болонке, заполнен-ной 10 мл Сефадекс С-50, обработан10

lå

26

50 ной 0,31J NaOH в течение 30 мин при е

70 С для ра",ðóïteíèÿ РНК, нейтрализуют НС1 и осуществляют гибридизацию, Для идентификации клонов р1.1 — pL30 используют быстрый процесс изолирования нлазмиды по Бирнбойму, При этом получаю- 1 мкг плазмиды.

ДНК из каждых 500 индивидуальных трансформантов Е,.со1 К-12 шта!м

294, Каждый образец ДНК денатурируют и наносят на нитроцеллюлознь,е фильтры в трех экземплярах, следуя методике Кафатоса с сотр. (см. выше).

Три группы нитроцеллюлсзных фильтров, содержащих 500 образцов плззмид> Гибридизьрчют со стимулированной кДНК, заложенной с Т-1 группой носителей информации (праймеров); Т-13, заложенной стимулированной кДНК, нестимулированной кДНК„ приготовленной с использов.-вием обеих групп носителей информации.

Клоны считают положительными, если они гибридизируют сильнее один или оба зонда стимулированной кДНК, чем полностью нестимулированный зонд.„

Было отобрано 30 положительных клонов (pL1-pL30) из 500 для дальнейшего анализа.

Трансформанты Е,со1 . х 1776 скринируют по методике гибридизации колоний, используя в качестве зонда

37

1 -меченную стимулированную мРНК, Немеченную мРНК из нестимулированных клеток смешивают с зондом при соотношении 200:1 для конкуренции с нестимулированной мРНК, имеющейся в з

P-меченном препарате. Гибридизация меченой MPHK будет происходить предпочтительно в колониях содержащих стимулированные последовательности.

Получают три класса трансформантов:. з

2-3% колоний, гибридизованных iмРНК очень сильно;. 10% гибридизован-ных значительно меньше, чем l-й класс; остальное, не даюшее определимый сигнал гибридизации,, Исследуют пслс...ительные колонии (классы 1 и 2) на наличие интерферон-специфических последовательностей с помощью анализа, который завиoит от гибридизации интерфероновой мРНЕ кснкретно в плазмиду ДНК. Первоначально выращивают индивидуально

60 сильно положительных колонии (класс 1) в 100 мл среды 119, дополненной тетрацикличсм (200 мкг/мл)

141431 9 ф диаминопимелнновой кислотой (100 мкг/мл), тимидином (20 мкг/мл), и d-биотином (1 мкг/мл).

Среда М9 содержит 6 г/л Na НРО, 3 г/л КН РО4 0,5 r NaC1 и 1 г/л NH Сl.

После автоклавирования прибавляют

1 мл стерильного 1И MgSO< и 10 мл стерильного 0,01 М СаС1 . Собирают

10 культур и изолируют плазмиду ДНК из шести пулов, как описано Клевеллом с сотр. Biochemistry 9, 4428-440 (1970). 10 мкг каждого пула плазмиды

ДНК расщепляют Hind III денатурируют и ковалентно связывают с ДБМ (диазобензилоксиметиловой) бумагой. На каждом фильтре гибридизуют 1 мкг очищенной мРНК из стимулированных кле.ток. Негибридизованную мРНК удаляют промывкой. Специфически гибридизованную мРНК элюируют и транслируют в социты личинок Xenopus. По этой пробе все 6 пулов были отрицательными.

5 пулов из 10 колоний каждый и 1 пул из 9 колоний делают из 59 слабо положительных колоний (класс 2). Готовят плазмиды из пулов и исследуют, как описано вьппе. Среды 6 тестированных пулов был тестирован один (к10), гибридизованный в интерферонную мРНК при условии значительно выше исходных уровней каждого времени. Для того, чтобы определить специфический интерферонный кДНК-клон готовят плазмиды ДНК из 9 колоний пула К10 и исследуют индивидуально. Две из девяти плазмид (9101 и h» 104) связывают ин,терферонную мРНК существенно лучше, чем при указанных исходных уровнях.

Из плазмиды В 104 выделяют один

Bgl II рестрикционный фрагмент, сот держащий 260 в.р., меченный Р с использованием процедуры, описанной

Тейлором с сотр.,и используют в качестве зонда для независимого скрининга 400 E.coli 294 трансформантов с помощью процедуры скрининга колоний

in situ.

Идентифицируют 9 колоний (pL 31pL 39), которые гибридизуют до различной степени с этим зондом.

Кроме того, используют меченный

260 в.р. фрагмент для независимого скрининга 4000 E.coli 294 трансформантов таким же образом. Индентифицируют 50 колоний, которые гибриднзуют до различной степени с этим зондом. Одна содержит 1,eIF G"ôðàãìåíò, одна — LeIF Н-фрагмент и одна — фрагмент, обозначенньп 1.eIF HI, очень похожий на LeIF Н. Полученные гибридные плазмиды обозначают pLEIF Н и т.п.

Готовят плазмиду ДНК из всех 39 потенциальных Ье?Г кДНК клонов и проводят повторный скрининг с тем же

260 в.р. ДНК зондом, используя процедуру гибридизации Кафатоса с сотр. (см. BbIHle). Три плазмиды (pL 4, pL 31, pL 34) дают очень сильные признаки (сигналы) гибридизации, четыре (pL 13, pL 30, pL 32, pL 36) гибри15 дизованы умеренно H TpH (pl, 6, pL 8, f>L 14) слабо гибридизованы зондом.

Также скринируют 39 потенциальных LeIF кДНК рекомбинантных плазмид

32. с использованием P-меченных синте20 тических ундекамеров (индивидуальные

Т-1 первичные пулы праймеров информации или индивидуальные Т-13 праймеры информации) непосредственно в качестве гибридизующих зондов. Условия

26 гибридизации выбирают таким образом, что для определимых сигналов гибридизации должны требоваться точно спаренные основания. Следовательно, плазмида ДНК из 3 клонов была приго30 товлена по стандартной процедуре очищения лизата (Клевелл с сотр., см. вьпне) и очищена колонной хроматографией на Биорад Агарозе А-50.

Образцы по 3 мкг каждого препарата делают линейными обработкой Есо

RI денатурируют в щелочи и наносят на 2 отдельных нитроцеллюлозных фильтра по 1,5 мкг на пятно (Кафатос с г сотр., см. выше). Фосфорилируют инди 0 видуальные синтетические деоксиолигонуклеотидные праймеры информации и пулы праймеров информации с помощью (р) ATP следующим образом:

50 пкмоль олигонуклеотида и 100 пкмоль ,(y ппр) АТР, (2500 Кю/ммоль) объединяют в 30 мкл 50 мИ трис-НС1, 10 мМ

MgC1<, 15 мИ Р-меркаптоэтанола. Добавляют 2 ед. Т4 полинуклеотидкиназы с о 7 и после 30 мин при 37 С, Р-меченные

50 праймеры информации очищают хроматогЬ афией в колонках с 10 мл Сефадекс

0-50. Гибридизации осуществляют с использованием 10 срм пула праймеб ров Т-13С или 3 10 срм пула праймера Т-1С при 15 С в течение 14 ч в бх SSC (1х$$С = 0,15 И NaCI, 0,015 М лимоннокислого натрия, рН 7,2, 10х раствор Денхардта (0,27. бычьего сывороточного альбумина, 0,27. поливи5 !4 нилпиролидона, 0,2Ж фиколла). Фильтры промывают 5 мин (3 раза) при 0 С бх SSC, сушат и облучают на рентгеновской пленке.

При этом плазмида ДНК из клона

104 дает значительную гибридизацию с пулом праймеров информации Т-1С и праймеров информации Т-13С, но не да, ет определимой гибридизации с други: ми ундекамерами. Несколько из 39 по, тенциальных LeIF плазмид (рЬ 2,4,13, 17,20,30,3 l,34) также гибридизуют с обоими этими зондами. Pst I-усвоение

pL 31 показывает размер кДНК-вставки, который должен составлять примерно

1000 в.р.

Найдено,„ что первый АТС-трансли; рующий начальный кодон состоит из, 60 нуклеотидов от 5 конца последоваI, тельности и затем 188 кодонов после TGA концевого триплета, имеется 342

3 нетранслируемых нуклеотидов у 3 кон, ца, следующих на поли-(A)-последовательностью„ Путативный сигнальный пептид (по-видимому, включенный в секрецию готового LeIE из лейкоцитов)

: имеет длину из 23 аминокислот. 165

; аминокислот, составляющих готовый

l LeIF, имеют рассчитанный молекулярный вес 19390, LeIF, закодированный, ;pL 31 обозначают LeIF А, SAU 3A рес, трикционный эндонуклеазный участок

: расположен между кодонами 1 и 3 РА.

Два синтетических деоксиолигонуклеотида включают ATG-транслирующий начальный кодон, реконструируют кодон аминокислоты 1 (цистеин) и создают

Есо RI липкий конец. Эти олигомеры были связаны в 34 в.р. SAU За-А all фрагмент pI. 31. Полученный в результате 45 в.р. продукт лигируют в два дополнительных фрагмента ДНК для конструирования 86,5 в.р. синтетического (натурального гибридного гена, Который кодирует LIF А и который связывается Eco Rl u Pst 1 .(рестрикционными участками). Такой ген включают в

pD R322 между Есо RI u Pst I участками для получения плазмиды PLIF AI

Конструкция триптофанового контрольного элемента, содержашего

E.coli trp промотор, оператор и игр лидер рибосомсвязывающего участка, но не содержащего ATC-последовательности для инициирования трансляции, Плаэмида рСМ1 несет триптофачовый оперон F..coli содержащий делецию

6L Е1413, и экспрессирует протеин, 14319 6 включающий первые 6 аминокислот trp .пидера и приблизительно последний третий trp Е полипептид (позже упоминаемый в сочетании как ЬЕ ), а также trp D полипептид в его целости, все под контролем системы trp промотор-оператор, Плазмиду (20 мкг) обрабатывают рестрикционным ферментом PVU II, который расщепляет плазмкду на пять участков. Генные фрагменты затем комбинируют с линкерами

Есо RI состоящими из самокомплиментарного олигонуклеотида с последовательностью рСАТСААТТСАТС, обеспечивая Есо R I-участок расщепления для последующего клонирования в плазмиду, содержащую Eco R 1-участок. Обрабать.— вают 20 мкг ДНК-фрагментов, полученных из pGNI, 10 ед. Т4 ДНК-лигазы в

I присутствии 200 пкмоль 5 -фосфорилированного синтетического олигонуклеотида pCATGAATTCATG и в 20 мкл

Т4 ДНК-лигазного буфера (20 мИ трис, 25 рН 7,6, 0,5 мМ АТФ, 10 мИ МяС1, 5 мИ О дитиотрейтола)при 4 С в течение ночи.

Затем раствор нагревают 10 мин при

70 С до прекращения лигации. Связки отщепляют перевариванием Есо R I u

Зр фрагменты, теперь с концами Eco R I отделяют, используя электрофорез на

5Х-ном полиакриламидном геле (ПАГЭ), и при наиболее широких фрагментах, выделенных из геля первым пятном с

З5 этидиумбромидом, локализуя фрагменты ультрафиолетовым светом, и вырезают из геля интересующие участки.

Помещают каждый гелевый фрагмент с 300 мкл 0,1 ТБЕ в диализаторный бачок и подвергают электрофорезу при

100 В в течение часа в 0,1>ТБЕ-буфере (ТБЕ-буфер содержит: 10,8 r трис-основания, 5,5 г борной кислоты, 0,09 г Ма — ЭДАТУК в 1 л воды). Вод .

45 ный раствор собирают из диализаторного бачка, экстрагируют фенолом, экстрагируют хлороформом, делают

0,2 М раствор хлористого натрия и извлекают ДНК в воце после осаждения этанолом, содержащий ген trp промотор-оператор с липкими концами

Есо RI идентифицируют по указанной ниже процедуре, которая вызь. вает вставление фрагментов в чувствительную к тетрациклину плазмиду, которая

35 при вставлении промотор-оператора становится устойчивой к тетрациклину.

Плазмида рВРН? экспрессирует ампициллиновую устойчивость и содермощью ПАГЭ н нзолнру,от после электроэлюировяния, Этот ДНК-фрагмент из рН S 32 (0,2 мкг;) связывают в условиях, подобных указанным выше. с Есо

R I-Tap I-фрагментом триптофянавого оперона (0,01 мкг), происходящего из рВ RH trp В ; пособе легирования фрягь ентя и- рП S 32 к фрагменту

Есо Я " — Тяя 1, кяк опксяно выше, выступающий вперед Ta- I конец связан с выступающим вперед концом

Х ba I, хотя он не совершенно спарен основанию Уятсона-Крика

-Е СТАСА — -ТСТАСА—

-AGC ТСТ -АССТСТ

Часть этой лигяционной реакционной смеси трансформируют в клетки Е.co1i

294, проводят термообряботку и помещают на пластины 1.В, содержащие ампициллин. Отбирают 24 колонии, выращивают в 3 мл LB (Луриа-Бертяни) среды и изолируют плазмиду. Найдено, что 6 из них имеют XbaI-участок,регенерированный с помощью Е.coli, катализированной ДНК повторным спариванием и репликацией

TCTAGA— — TCTAGA—

AGCTCT— AGATCT

Найдено, что эти плязмиды расщепляются кяк Eco R I, так и Нра I и дают ожидаемые рестрикционные фрагменты, Одну плазмиду, обозначенную

pTrp 14, используют для экспрессии гетерологических полипептидов, Плазмидя pHGH 107 содержит ген человеческогс гормона роста (ЧГР), составленный из 23 яминокислотных кодонов, полученных из синтетических

ДНК-фрагментов, и 163 яминокислотных кодонов, полученных из комплементарной ДНК, полученной с помощью обратной транскрипции информационной PHK

ЧГР. Этот .ген, хотя в нем отсутствуют кодоны pre последовательности

ЧГР, содержит ATG-транслирующий начальный кодаи. Этот ген изолируют из

10 мкг pHGH 107 после обработки Есо

R I с последующей обработкой Е.coli

ДНК полимерязой Кленоза фрагмента и

Й ТТР и Й АТР.„. кяк указано вышее. После экстрякции фенолом и хлороформом и осаждения этянолом плазмиду обрабатывают Вяш Н1.

Фрагмент, содержащий ген ЧГР, изолируют с помощью ПАГЭ с последующим электроэлюированием, Полученный в результате ДНК-фрагмент также содержит

7 14! 4319 жит ген устойчивости к тетряциклину, Следовательно, плазмидя чувствительна к тетряциклину. Плазмиду делают устойчивой к тетряциклину путем введения системы промотор-оператор в участок EcoRI, pBRHI расщепляют EcoRI и удаляют фермент экстракцией фенолом с последующей экстракцией хлороформом и со- 10 бирают в воде после осаждения этянолои. Полученную в результате молекулу ДНК в отдельных реакционных смесях объединяют с каждым из трех фрагментов ДНК, полученных вышее, и лигируют с Т ДНК-лигазой, как описано выше.

Используют ДНК, находящуюся в реакционной смеси, фея трансформации Е.coli

К-12 штамма 294 по стандартной методике и бактерии помещают на LB 20 (Luria-Bertani)-пластины, содержащие

20 мкг/л ампициллина и 5 мкг/л тетрациклина. Отбирают несколько устойчивых к тетряциклину колоний, изолируют плазмиду ДНК и доказывают наличие же- 25 даемого фрагмента с помощью рестрикционного ферментного анализа. Полученную плазмиду обозначают pB RH trp.

Продукт расщепления с помощью

Есо К I n Вям Н I вирусного генома 30 гепатита В получают традиционным способом и клонируют в Eco R I u Bam

Н I участки плазмиды р С Н 6 для образования плазмиды рН $ 32. Затем расщепляют плазмиду рН S 32 с помощью 3

X ba I, экстрагируют фенолом, хлороформом, осяжцают этанолом и обрабатывают 1 мкл Е.coli ДНК полимеразой

I Klenov фрагмент (Боерингер-Ман" нхейм) в 30 мкл полимеразного буфера 0 (50 мИ фосфата калия рН 7,4 мИ ИрС1

1 мМ Р-меркаптоэтанола), содержащего

0,1 мИ d TTP и 0,1 мМ, d CTP, в течение 30 мин при О С, затем 2 ч при

37 С. Такая обработка приводит к заполнению 2 из 4 нуклеотидов, комплементарных к выступающему вперед 5 концу X ba I участка расщепления, 5 СТАСА 5 . СТАСА

3 Т 3 ТСТ 60

Два нуклеотида, dC и dT, были включены и дали конец с двумя выступаюI щими вперед 5 нуклеотидами. Такой линейный остаток плазмиды рН S 32 (после экстракции фенолом и хлороформом и сбора в воде после осаждения этанолом) расщепляют Есо R I, отделяют широкий плазмидный фрагмент от меньшего Есо Р I-ХЬа1-фрагмента с по9 94143 первые 350 куклеотидон устойчивого к тетрациклину структурального гена, но в нем отсутствует тетрациклиноная система промотор-оператор, так что при последовательном клониронании н

5 экспрессионную плазмиду плазмиды, содержащие вставку, могут быть обнаружены по восстановлению устойчивости к тетрациклину. Так как Есо R I конец .,0, фрагмента был заполнен в процедуре полимеразой I Кленова, фрагмент имеет один тупой и один лигкий ко нец, обеспечивающий четкую ориентацию при последующем включении н экспрессивную плазмиду., Затем готовят экспрессивную плаз: миду pTrp 14 для получейия фрагмента,, содержащего ЧГР-ген, приготовленного ранее ° pTrp 14 расщепляют XbAI и полу-20

,ченные липкие концы заполняют.по про цедуре полимеразой I Кленова, приме няя d ATP, d TTP, dG ТР и d CTP. Ilocле экстракции фенолом и хлороформом и осаждения этанолом полученную в 25 результате ДНК обрабатывают Вата H I ,и изолируют полученный в результате, широкий плазмидный фрагмент с помо, щью ПАГЭ и электроэлюиронания. Фраг мент, происходящий из pTrp 14, имеет

; один тупой и один липкий конец, поз-! ! воляющий рекомбинацию с четкой ориен тацией с фрагментом, содержащим ЧГР( ген, описанный ранее.

Фрагмент гена ЧГР и фрагмент pTrp

14 ЬXba-Ram Н I объединяют и лигируют в условиях, подобных опис.анным выше.

Заполненные XbaI и Есо R I концы, связанные вместе связкой по тупому концу для воссоздания участков XbaI и Есо Н. 1: заполненный ХЬа1 заполненный Есо К 1 инициирование геном ЧГР

-ТСТАС AATTCTATG- -TCTAGAATTCTATG+

-АСАТС TTAAGATAC -AGATCTTAAGATACXbaI Eco R I

Такая конструкция также воссоздает ген устойчивости к тетрациклину.

Так как плазмида pHGU 107 экспрессирует устойчивость к тетрациклину из промотора, расположенного выше гека

ЧГР (1ас-промотор), эту конструкцию обозначают pHGH 207,она позволяет осуществить экспрессию гена устойчивости . к тетрациклину под контролем триптофа-6 нового промотора-оператора. Лигационную смесьтрансформируют в Е.со"гi 294 и отбирают колонии на LB-пластинах, содержащих 5 мкг/л тетрациклина, 19 10

Плазмиду рН СН 207 расщепляют

Есо R I с помощью ПАГЭ и электроэлюиронания и выделяют фрагмент, содержащий trp промотор,оператор и trp ведущий рибосомный связующий участок,но в котором отсутствует ATG-последовательность для инициирования трансляции. Этот фрагмент ДНК клонируют и

Есо R I участок pLeIF A. Экспрессионные плазмиды, содержащие модифициронанный выше trp регулон (Е,coli

trp onepoz, из которого была изъята истощенная последовательность для контролируемого повышения уровней экспрессии), вырашинают до заранее определенных уровней в питательной среде, содержащей добавку тринтофана н количестве, достаточном для по давления (репрессии) системы промотор-оператор, затем изымают триптофан, чтобы дерепрессиронать систему и вызвать экспрессию целевого продукта. Для этого 250 мкг плазмиды

pL 31 расщепляют pst I и изолируют

1000 н.р. вставку гель-электрофорезом на 6Е-ном полиакриламидном геле.

Из геля элюируют примерно 40 мкг вставки и разделяют на три аликвота для дальнейшего расщепления образца

16 мкг этого фрагмента частично расщепляют 40 ед. B8l II в течение о

45 мин при 37 С и очищают реакционную смесь на 6Х-ном полиакриламидном геле. Собирают приблизительно

2 мкг целевого 670 в.р. фрагмента.

Другой образец (8 мкг) из 9000 н.р.

pst I вставки рестриктируют А v aII и Bg1. II Собирают 1 мкг указанного

150 в.р. фрагмента после гель-электрофореза.

Обрабатьгвают 16 мкг 1000 н.р. часть HAU 3a z А v aII, После электрофореза на 10 -,ном полиакриламидном геле собирают приблизительно 0,25 и,-. (10 пкмоль) 34 в.р. фрагмента.

Синтезируют два указанньгх дезокси( олигонуклеотида 5 — d AATTCATGTGT (фрагмент 1) и 5 - d-GATCACACATG (фрагмент 2) по фосфоротриэфирной процедуре.

Фрагмент 2 фосфорилируют следующим образом.

Высушивают 200 мкл (40 пкмоль) () - р) — АТР (ersham 5000 Кю/ммоль) и повторно суспендируют н 30 мкл

60;гН трис-НС1 (рН 8), 10 мМ МЕС1

15 мМ 9-меркаптоэтанола, содержащего 100 пкмоль ДНК фрагмента и 2 ед.

1l

1 Р

Т4 полннуклеотидной киназы. После о

15 мин при 37 С прибавляют 1 мкл

10 мИ ATP и реакция продолжается еще

15 мин, Затем смесь нагревают при о

70 С в течение 15 мин объединяют с

Э

100 пкмоль 5 -ОН фрагмента 1 и

10 пкмоль 34 в.р. SAU За-А ч аТТ фрагмента. Связывание осуществляют о в течение 5 ч при 4 С в 50 мкл 20 мИ трис-НС1 (рН 7,5), 10 мИ ИрС2 . 10 мИ дитиотрейтола, 0,5 мИ АТР и 10 ед. Т4

ДНК лигазы. Смесь подвергают электрофорезу на 67-ном полиакриламидном геле и электроэлюированием собирают

45 в.р. продукт. Объединяют 30 нг (1 пкмоль) 45 в.р. продукта с 0,5 мкг (5 пкмоль) 150 в.р. А.ч all-Вр1 2-го фрагмента и 1 мкг (2 пкмоль) 670 в.р.

Bgl II-Pst 1-ro фрагмента. Лигировао ние осуществляют при 20 С в течение

16 ч, используя 20 ед, Т4 ДНК лигазы.

Лигазу инактивируют, нагревая при

65 С в течение 10 мин, Затем смесь усваивают Есо R I H Pst I для удаления полимеров иэ гена. Смесь очищают . на 6_#_.-ном ПАГЭ. Изолируют около 20 нг, (0,04 пкмоль) 865 в.р. продукта. Половину этого продукта (1О нг) лигируют в pBR 322 (0,3 мкг) между сайтами Eco R Х и Pst I. Трансформация

Е.coli 294 дала 70 устойчивых к тетрациклину, чувствительных к ампициллину. трансформантов. Плазмиду ДНК, изолированную из 18 иэ этих трансформантов, расщепляют Есо К Т и Рз I.

16 из 18 плазиид имеют Есо R I-Pst 1 фрагмент 865 в.р. в длину. Расщепляют 1 мкг одной из них, pLeIF А I, Eco R I и лигируют в 300 в.р. Есо R I фрагмент (0,1 мкг), содержащий Е.coli

trp промотор и ведущий рибосомный связывающий сайт, приготовленный, как описано вьппе. Идентифицируют трансформанты, содержащие trp проиотор, используя P-trp зонд в сочетании с процедурой скрининга колоний Грюнштейна-Хогнесса. Асимметрично расположенный Xbal сайт в .trp фрагменте позволяет определить рекомбинанты, в которых trp-промотор ориентирован в направлении LeIF А гена.

Определение активности LeIF А.

Экстракты готовят для IF анализа следующим образом. мл культуры выращивают в 6 -бульоне, содержащем 5 мг/мл тетрациклина до значения А п0 около 1,0. Затеи разбавляют 25 мл среды И9, содержа! 4319 12 зают с помощью pst 1, выделенной м электрофореэом, и метят изотопом P.

Полученную в результате радиактивно меченную ДНК используют в качестве зонда для скрининга дополнительных

Е.coli 294 трансформантов, полученных по способу, идентичному описанному в части С по методике in situ скрининга колонии, предложенной Грунштейном и Хогнессом (см. вьппе). Колонии, которые в различных количест4 вах гибридизировали с зондом, выде ляют Плазмиду ДНК из таких колоний и десять гибридизированных колоний, на которые ссылаются вьппе, с помощью

Pst I и характеризуют тремя различныии способами. Во-первых, образцы рестракционного эндонуклеаэного расщепления с знзимаии Hgl II, PVU II и Eco R I. Такой анализ позволяет классифицировать по крайней мере во55 семь различных типов (LeIF A, LeIF В, LeIF С, Т.еХР П, LeIF Е, LeIF F, LeIF G, LeIF Н), что соответствует приблизительно положению различных рестрикционных разрезов относительно

18

2Б

30 щей 5 мкг/мл тетрацнклина. 10 мл образцы собирают центрифугированием, когда А э достигнет значения 1,0 и гранулированные клетки суспендируют в 1 мл 15 раствора сахарозы, 50 мИ трис-НС1 (рН 8,0), 50 мИ ЕДТА. Добавляют 1 мг лиэозима и через 5 мин ино кубацни при 0 С клетки разрушают воздействием ультразвука. Образцы центрифугируют в течение 10 мин (15000 об/мин) и активность интерферона в верхнем слое определяют сравнением со стандартами LeIF с помощью цитопатического эффекта (СРЕ) ингибирования. Для определения числа ТГ молекул на клетку используют LeIF удельную активность порядка 4 ° 10 ед/мг

Клон pLeIF А trp 25, в котором

trp промотор вставляют в желаемой ориентации дает высокие уровни активности (до 2,5 10 ед/л), Полученный с помощью Е ° coli К-12 штамма

294/pLeIF А trp 25 ведет себя подобно аутентичному человеческому LeIF, он устойчив к обработке при рН 2 и нейтрализуется античеловеческими лейкоцитарными антителами кроликов. Такой интерферон имеет кажущийся молекулярный вес приблизительно 20000, Выделение с ДНК дополнительных лейкоцитарных интерферонов, ДНК из

LeIF с ДНК"содержащей плазмиды выре13 14143 известной в настоящее время предварительной последовательности и кодирую-. щей последовательности.

Во-вторых, некоторые из ДНК испы5 тывают на гибридизационный выбор для установления способности селективно удалять LeIF u RHK из поли-А, содержащей KG-1 клеточной РНК, Согласно этому анализу LeIF А, 8 С и F дают положительные результаты, В-третьих, последние фрагменты внедряют в экспрессионную плазмиду Е.coli 294,, трансформируют с плазмидой и фрагменты экспрессируют. Продукты такого экспрессирования представляют собой пре-интерфероны, дают положительные результаты при CPE анализе на активность интерферона, хотя и обладают маргинальной активностью в случае 20

1.eIF Г-фрагмента.

В последовательности изолированного фрагмента, содержащего ген зрелого LeIF В, первые четырнадцать нуклеотидов гипов А и В были идентичны. 25

В соответствии с этим фрагмент из

pLeIF А 25, несущий trp промотор-orre. ратор, место присоединения рибосомы и начало LeIF А(=В) гена, вьделяют и соединяют с остающейся частью В последовательности в экспрессионной плазмиде.

Для получения приблизительно

950 в.р. SAU За к Pst фрагменту необходимо несколько стадий ввиду наличия одного или более чередующихся

SAU За рестракционных сайтов„

1. Вьделены следующие фрагменты:

a). .1 10 в.р. от SAU 3a до Есо R I, в) Q 132 в,р, от Есо R I до Xba, О с) 700 в.р. от Xba до Pst, 2. Фрагменты (1а и 1в) лигируют и разрезают с помощью ХЬа и Bgl II с тем, чтобы предотвратить самополимеризацию через SAU За и Xba концевые терминалы (соответствующий SAU 3a сайт находится внутри сайта Bgl II, Bgl II разрезают с тем, чтобы оставить SAU 3a — липкий конец), Выделяют 242 в.р. фрагмента.

3. Продукт со стадий (2) и (1с) лигируют и разрезают с помощью Pst I и Bgl II для того, чтобы предотвратить самополимеризацию. Вьщеляют при- В,. близнтельно 950 в.р, фрагмента от

SAU За до Pst. Такой фрагмент содержит часть LeIF B гена, не характерную для LeIF А.

19 14

4. Приблизительно 300 в,р. фрагмента от Hind III до SAU За, содержащего trp промотор-оператор, сайт присоединения рибосомьt, ATG начальный сигнал и цистеиновый кодон 1.еТГ А, выделяют из pLeIF А 25.

5. Приблизительно 3600 в.р. фрагмента Pst I — Hind III вьделяют из

pB R 322. Такой фрагмент содержит ренликон и кодированный тетрациклин, но не обладает устойчивостью к ампициллину, 6, Фрагменты, полученные на стадиях 3 4,5 лигируют и полученную в результате плазмиду трансформируют в

Е,coli К-12 штамм 294.

Трансформанты подвергают минискринйнгу и образцы плазмиды расщепляют с помощью Есо R 1. Продукты такой реакции представляют три фрагмента со следующими характеристиками: Eco R IЕсо R I trp промоторный фрагмент, внутренний Есо R I — Есо R I — Есо КЧ фрагмент pL4 и протеин-трансляционный начальный сигнал — Eco R I фрагмент

pL4.

Согласно CPE анализу бактериапьные экстракты из клонов, полученных ука занным способом, обычно имеют примерно 10 10 ед. интерфероновой активности Hà литр при A » =. 1 . Один из таких клонов, полученных указанным способом, представляет собой

Е.coli 294/pLeIF В trp 7.

Прямое экспрессирование дополнительных зрелых лейкоцитарных интерферонов (LeIF С. D, F, Н, I v L).

Дополнительные генные фрагменты полной длины, которые содержат друг е LeIF типы, могут быть преобразованы в последовательность и помещены в экспрессионные векторы" для экспрессирования, как это имеет мес-" то в случае LeIF А.

Короткая длина синтетической ДНК, обрывающаяся на 3 -конце кодирующей спирали, с трансляционным начальным сигналом ATG затем лигируют, например, путем лигирования тупого конца к полученному в результате сшитому гену для зрелых интерферонов, ген внед. ряют в экспрессионную плазмиду и регулируют с помощью промотора и связанного с ним сайта присоединения рибо.= O Mhl

Согласно способу, аналогичному оп санному вьппе, генные фрагменты, ко",чрующие LeIF С и LeIF Р, соответ! 6

14 14319

) 5 ствующим образом конфигурируют для прямого бактериального экспрессирования, Экспрессионная стратегия для таких дополнительных лейкоцитных интерферонов в каждом случае включаВ ет использование приблизительно

300 в.р. фрагмента (Hind III-SAU 3a), содержащего trp промотор-оператор, сайт присоединения рибосомы, АТС-начальный сигнал и цистеиновый кодон

LeIP А иэ pLeIF А 25. К нему присоединяют генные фрагменты из дополнительных интерфероновых генов, копирующих их соответствующие последовательности аминокислот выше исходного цистенна, присущего всем последовательностям. Каждую полученную в ре-" зультате плаэмиду используют для трансформации E.coli К-12 штамм 294, Из pLeIF С выделяют следующие фрагменты: а) 35 в.р. SAU 3A-SAU 96, в). 900 в.р. SAU 96 — Pst I, с) выделяют приблизительно 300 в.р. фрагмента (Hind III — SAU 3a) из pLeIF 2б

А 25 аналогично описанному в части 4, d) выделяют приблизительно 3600 в.р, фрагмента согласно части 5.

Построение.

1. Лигируют (а) и (с). Расщепление проводят с помощью Bgl II

Hind III и выделяют приблизительно

335 в.р. продукта.

2, Проводят тройное лигирование (1)+(Ь)+(й) и трансформацию E.coli

35 с помощью полученной в результате плазмиды.

Соответствующий клон полученный таким образом, представляет собой

R.coli K-12 штамм 294/yLeIF С trp 35. 4, LeIF В.

Иэ р1.еТР 0 выделяют: a) 35 в.р.

SAU ЗА — А ч aII, в) 150 в.р. А v aIIBgl II, с) приблизительно 700 в.р.

Bgl II — Pst Iå

Из pLeIF A 25 вьщеляют: d)

300 в.р. Hind III — SAU За.

Из рВ К 322 выделяют: е) приблизительно 3600 в.р. Hind III — Pst I.

Построение.

1. Лигируют (а)+(Ь), разрезают с помощью Bgl II и очищают 185 в.р. продукта (1).

2. Лигируют (1)+(й), разрезают с

noraos1se Hind III, Bgl II и очищают приблизительно 500 в.р. продукта (2).

2. Лигируют (2)+(с)+(е) и трансформируют Е.coli с помощью полученной в результате плазмиды.

CooTsеTcтвуюшнЙ к 0ii полу keHHblfi таким способом „представляе T собой

Е.cali К-12 штамма 294/pLeII D trp 11.

LeIF Г содержащий фрагмент может бьггь сшит для прямого экспрессирования через пересборку, упрлценную полной гомологией аминокислот 1-13 LeIF В и

LeIF Г trp промотср-содержапнгй фрагмент (а) с соответствующим образом конфигурнрованными концамн получают иэ ЧГР 207 согласно описанному вьппе, через Pst I u Xba I-расщепление с последующим выделением приблизительно

1050 в.р, фрагмента. Второй фрагмент (Ь) получают в виде более крупного из фрагментов, полученных Pst I u

Bgl II расщеплением плаэмиды рНК Y 10.

Фрагмент (а) содержит приблизительно половину гена, кодирующего устойчивость к ампициллину, фрагмент (Ъ) — остаток гена и полный ген, кодирующий устойчивость к тетрациклину.

Фрагменты (а) и (Ь} объединяют через

Т4 лигаэу и продукт обрабатывают ХЬа I и Bg II для подавления димеризации с образованием фрагмента (с), содержащего trp промотор-оператор и гены устойчивости к тетрациклину и ампициллину.

Фрагмент (d), содержащий приблизительно 580 в.р., получают расщеплением pLeIP Г под воздействием

А Ya II u Bgl II. Он содержит кодоны аминокислот 14-166 LeI1 F.

Фрагмент (е) (49 в.р ° ) получают расщеплением pLeIF В под воздействием Xba I и А у aII. Фрагмент (е) кодирует аминокислоты 1-13 LeIF F;—

Фрагменты (с), (d) и (е) подвергают тройному лнгированию в присутствии 1.Т4-лигаэы. Когеэионные концы соответствующих фрагментов такие, что композиционная плаэьщца находится в состоянии правильной циркуляции и при этом ген устойчивости к тетрациклину находится под контролем trp промотора-оператора совместно с геном зрелого LeIP F так что бактерии, трансформированные с помощью желаемой плазмиды, могут выбираться из пластин содержащих тетрациклнн. Клок, полу" ченный таким образом, представляет собой Е.coli К-12 штамм 294/pLeIF Г

trp 1.

Полный Т,еХГ Н-ген может быть конфигурирован для экспрессирования в виде зрелого лейкоцитарного интерферона согласно следукщему.

14143

1. Плазмиду р?.еТГ И подвергают гидролизу в присутствии Нае II

RS aI с выделением 816 в,р. фрагмента, простирающегося от сигнального

t 5 пептида аминокислоты 10 до 3 некодирующего участка.

2. Фрагмент денатурируют и подвергают синтезу с фрагментом Кленова

ДНК полимеразы 1 с использованием синтетического дезоксирибо-олигонук леотидного праймера 5 -ATCTGTAATCTGTCT; !

3. Полученный в результате продукт расщепляют с помощью SAU 3a и выделяют 452 в.р. фрагмента, представляющего собой аминокислоты 1-150.

4. В результате расщепления LeIF Н с помощью SAU 3a и Pst.1 и вьделения полученного в результате. 500 в.р. фрагмента получают ген, кодирующий аминокислоты от 150 до конца кодирующей последовательности.

5. Фрагменты, вьделенные на стадиях (3) и (4), лигируют с образованием фрагмента 25

1 166

met cys asp stop

ATG TGT,. +,. GAT TGA — . ° . — Pst I

SAU За кодирующего 166 аминокислоты LeIF-H. 30

6. рТ.еТЕ А trp 25 расщепляют с помощью ХЬа Т, лигируют тупые концы с помощью ДНК полимеразы 1 и продукт . реакции расщепляют с помощью Pst I °

Полученный в результате большой фраг35 мент может быть выделен и лигирован с продуктом со стадии (5) с образованием экспрессионной плазмиды, способной после трансформации Е.coli

К-12 штамма 294 или другого бактери- 4 ального хозяина экспрессировать зрелый LeIF Н. A --фазную Чарок 4А рекомбинатную библиотеку человеческого генома подвергают скринингу на лейкоцитарные интерфероновые гены. Радиоактивный

LeIF-зонд, полученный из сДНК клона

LeIF A, используют для скрининга

500000 колоний. Несть LeIF геномных клонов получают в результате такого скрининга. В результате последующего скрининга и очистки колоний один из таких клонов, Q H LeIF 2, выбирают для дальнейшего анализа.

С использованием указанного способа могут применяться и другие зонды с тем, чтобы успешно провести выделение дополнительных 1.eIF клонов из человеческого генома. Они, в

19 18 свою очередь,, могут использоваться для получения дополнительных лейкоцитарных интерфероновых протеинов согласно изобретению.

1, 2000 в.р. Есо R I фрагмент клона Х Н I,eIF 2 клонируют в pBR325 .на сайте нахождения Fco R I, Полученную в результате плазмиду LeIF I расщепляют с помощью Есо Н Ти вьделяют 2000 в.р. фрагмента. Деоксиолигонуклеотидный d AATTCTGCAG (конвертор Есо R I — Pst I) лигируют до

2000 в .р. Eco R I фрагмента и получен ный в результате продукт расщепляют г помощью Pst Т с образованием 2000 в.р фрагмента, содержащего Pst I-концы.

Этот продукт расщепляют с помощью

SAU 96 и 1100 в.р. фрагмент вьделяют.

2. Плазмиду pLeIF С trp 35 расщепляют с помощью Pst I и ХЬ aI. Вьде" ,пяют крупный фрагменто

3. Небольшой ХЬ aI — Pst I фрагмент из pLeIF С trp 35 расщепляют с помощью ХЪ аТ и $АУ 96. Выделяют.

40 в,р. ХЬ aI — SAU 96 фрагмента.

4. Фрагменты, вьделенные на стадиях (1), (2) и (3), лигируют с образованием экспрессионной плазмиды

pLeIF I trp 1. LeIF J.

1. Плазмида pLeIF J содержит 3,8;, Hind III фрагмента человеческой геномной ДНК, которая включает LeIF 3 генную последовательность, и выделяют 700 в.р. Dde I — RSa I фрагмент, 2. Плазмиду pLeIF В trp 7 расщепляют с помощью Hind III u Dde I u выделяют 350,в.р. Hind III-Dde I фрагмент.

3., Плазмиду рВ R 322 расщепляют с помощью Pst Т, затупляют концы в результате инкубирования в присутствии ДНК полимеразы I (кленовский фрагмент), затем расщепляют с помощь!-..

Hind III и выделяют крупный

{ м 3600 в.р .) фрагмент, Фрагменты, вьделенные на стадиях (1) (2) и (3), лигируют с образованием .экспрессионной плазмиды

РТ,еТЕ J trp I, Очистка интерферона, 1. Замороженные клеточные гранулы„ содержащие экспрессированный лейкоцитарный интерферон, раздробляют вручную или с использованием соответствующего оборудования для уменьшения размера частиц, Частично оттаявшие клетки суспендируют в 4 об .буфера А, содержащего 0,1 И трис (pH 7,5-8,0), ВНИИЛИ Заказ, 3796/58 . Тираж 520 Подписное

Произв.-полигр. пр-тие„ г. Ужгород, ул. Проектная, 4

10% (вес/об) сахароэы, 0,2 И NaC1.

5 мИ ЕДТЛ9 О, 1 мИ РИНГ и 10-100 мИ

ИяС1, Такую суспекзию выдерживают при температуре приблизительно 4 С, Полученную суспекэию пропускают через гомогекизатор, работающий по, давлением 6000 фунт/дюйм, после чего снова пропускают через указакное устройство, но при давлении :,0

1000 фунт/дюйм . Эффлюент иэ гомогениэатора от двух проходов охлаждают в бане со льдом.

2. Иедленно добавляют полиэтиленимин к гомогенной среде до концент- 15 рации около 0,35 и полученной системе дают выстаиваться в течение 30 мин, Твердые вещества удаляют центрифугированием или фильтрацией. Температуру на этой стадии контролируют или проводят ее достаточно быстро, в результате чего верхний слой (фильтрат) поддерживается при температуре менее 10 С. Верхний слой (фильтрат) концентрируют ультрафильтрацией при- 25 близительно до 1/10 начального объема. Иелкие частицы или туманность в удержанной фазе можно удалить на соответствующем фильтре, например на микропористой мембране. ЗО

3. Осветленный раствор загружают непосредственно в колонку с моноклональным антителом со скоростью подачи 5-8 см/ч (например, 25-40 мл/ч в колонку с диаметром 2,6 см). После загрузки колонку промывают приблизительно 10 об 25 мИ трис-НС1 РН

7,5-895, включающего NaC1 (0,5 И) и . такое поверхностно-активное вещество, как Тритон-Х-100 (0,2%) или его эквивалент, После промывки колонку споласкивают приблизительно 10 об раствора, содержащего 0,15 И NaC1 и йоверхностно-активное вещество, такое как Тритон Х-f00 (0,1%) или его эквивалент. Колонку элюируют

0,2 N раствором уксусной кислоты, содержащим такое поверхностно-активное вещество, как Тритон-Х-100 (0,1 ) или его эквивалент, Фракцию, дающую протеиновый пик из колонки с моноклональкым антителом (согласно УФспектроскопическому или другому ана19 20 лизу), объедки:ют и рН системы устанавливают рав..ым гриблиэителько

4,5 с помощью О,l 1 раствора НаОН или 1,0 И трис-основаниями.

4. Объединенный иктерфероковый пик загружают ка катиокообменкик, такой как Ватман СИ 52 целлюлоза или его =". вивалект, который уравновешивают подхоцчщ.:.и буфером„ .таким как ацетат аммокия9 рН 4,5 (50 мИ). После загрузки колонку промывают уравновешивающим буфером до того момента, пока УФ-спектр дает ровный прямой при анализе элюекта, в результате че го небольшое количество эффлюента злюируется с колонки. Затем колонку элюируют 25 мИ ацетата аммония и

0,12 И хлористого натрия или их комбинацией, которая оптимизирует регекерацию интерферона и приводит к образованию лиофилизироваккого осадка на фильтре.

Формула изобретения

Способ получения лейкоцитарных ин" терферонов человека с частичной последовательностью Суэ-Аlа-trp-Glu-Val-Val-Агр-Аlа-Glu-I lе- Iet-Àrg-

-Ser-, предусматривающей трансформацию бак-ерий Е.coli штамм 294

АТСС 31446 плаэмидами, выбранными из группы pLeIF А 25, pLeIF В trp 7, pLeTF С trp 35, pI,eIF D trp 11, pl eIT Г trp I, pLeIF Т trp f, pLeIF

3 trp I, культивирование полученных трансформаторов с последующим экстрагированием и очисткой полученных полипеп-.идов.

Приоритет по признакам:

01..07.80 при частичной последовательности Cys-Ala-trp-Оlu-Val-Val-Arg-Ala-С1и-11е-Net-Arg-Беr-.9

pLeIF А 25, pLeTFB trp 7, Escherichia co1i АТСС 31446:

08.09 80. при pI.eTF С trp 35, pLeIF D rp f l, pLeIF F trp I.

10. 11.80 при pl.,eIF I trp I, pLeIF 3 trp 1.

21.04.81 при экстрагировакии и очистке полученных полипептидов.