Способ получения регенерантов протопластов дрожжей sасснаrомyсеs cerevisiae

 

Изобретение относится к области) биотехнологии и генетической инженерии, касается .получения регенерантов протопластов дрожжей Saccharomyces cerevisiae и может быть использовано в генетико-селекционных работах. Целью изобретения является повьшение выхода регенерантов дрожжевых протопластов , что увеличивает вероятность отбора клонов дрожжей с нужными генетическими свойствами. Способ заключается в том, что протопласты перевнесением в регенерационнзпо среду предварительно инкубируют в течение 0,5-3 ч в питательной среде УРД, дополненной антиоксидантом 2,6-дитретбут11п-4-метил(Ьенолом (ионолом) в концентрации 2-5 мкг/мл. 2 табл. iS (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) (1) 4 С 12 N 15/00, 1/18, 1/16

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4107708/31-13. (22) 18.08.86 (46) 15.05.88. Бюл. Р 18 (71) Институт молекулярной биологии и генетики AH УССР (72) 1().И.Горлов, В.С.Кириллова, Л.Г.Жарова и В.А.Кордюм (53) 663.15 (088.8) (56) Svoboda А., Necac О. Regeneration of yeast protoplasts prepared .

by snail enzyme. — Nature, 1966, ч. 210, 0 5038, р. 845-847.

Terenczy L., Maras А. Transfer of

mitochondria by protoplast fusion in

Saccharomyces cerevisiae. — Nature, 1977, v. 268, В 11, р. 524-525, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕГЕНЕРАНТОВ

ПРОТОПЛАСТОВ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES

CEREVISIAE (57) Изобретение относится к области! биотехнологии и генетической инженерии, касается .получения регенерантов протопластов дрожжей Saccharomyces

cerevisiae и может быть использовано в генетико-селекционных работах °

Целью изобретения является повьппение выхода регенерантов дрожжевых протопластов, что увеличивает вероятность отбора клонов дрожжей с нужными генетическими свойствами. Способ заключается в том, что протопласты пере. внесением в регенерационную среду предварительно инкубируют в течение

0,5-3 ч в питательной среде УРД, дополненной антиоксидантом 2,6-дитретбутил-4-метилйенолом (ионолом) в концентрации 2-5 мкг/мл. 2 табл.

1395674

Изобретение относится к биотехнологии и,генетической инженерии и касается получения регенерантов протопластов дрожжей Saccharomyces сегечХз1ае и может быть использовано в генетико-селекционных работах.

Целью изобретения является повышение выхода регенерантов дрожжевых протопластов, что увеличивает вероят-10 ность отбора клонов дрожжей с нужны,. ми генетическими свойствами. !

Способ заключается. в том что npd1 топласты перед внесением в регенерационную среду дополнительно инкуби5 руют в течение 0,5-3 ч в питательной среде УРД состава, г/л: дрожжевой экстракт Цифко 10, пептон Дифко 15,,глюкоза 20, сорбит 146, дистиллиро ванная вода 1 л в присутствии анти оксиданта 2,6-дитретбутил-4-метилфе,нола (ионола) в концентрации 2.;5 мкг/мл.

Изобретение позволяет повысить вы:,ход регенерантов протопластов, чтo, ! увеличивает вероятность отбора клонов дрожжей с нужными генетическими свойствамии.

Пример 1. Протопласты дрожzrefi Saccharomyces cerevisiae LL 20 по-3 ,лучают по следующей методике. Клетки

1 дрожжей выращивают в питательной сре,де УРД, содержащей,г/л дистиллирова нной воды: дрожжевая азотная основа

Дифко 6,7; пептон Дифко 1 и глюкоза

20, в условиях аэрации среды на качалке (180 качений/мин) до досьтиже ния культурой логарифмической фазы роста (2-4 10 кл/мл). Из 20 мл культуральной среды клетки осаждают центрифугированием (3000 g, 5 мин), осадок отмывают двумя объемами (40 мл) стерильной дистиллированной воды при центрифугировании в тех же условиях. Отмытый осадок ресуспендируют в 2 мл среды для получения протопластов, содержащей 0,6 М КС1, О, l М КН РОо, О 2 МНа 80з (рН 7,1).

В полученную суспенэию добавляют

0 1 мл пищеварительного сока улитки.

Суспенэию инкубируют при осторожном перемешивании (50 качаний/мин) при

30 С s течение 8"10 мин. Полученные протопласты отмывают два раза пятью объемами 0,8 g сорбита при центрифугировании (3000 g 5 мин). Отмытый осадок протопластов ресуспендируют в

20 мл среды УРД, содержащей, г/л: дрожжевой экстракт Дифко 10, пелтон

Дифко 15, глюкоза 20, сорбит 146, добавляют 2,6-дитретбутил-4.-метилфенол (ионол) до конечной концентрации 25 мкг/мл (для сравнения берутся и другие концентрации), причем ионол предварительно растворяют в зтаноле, и смесь инкубируют при медленном перемешивании (50 качаний/мин) в течение о

0,5-3 ч при 30 С (суспензия протопластов разбивается на варианты по 1.мл).

Затем протопласты центрифугируют осадок отмывают 5 объемами 0,8 М сорбита в условиях центрифугирования при

3000 g 5 мин. Отмытый осадок протопластов ресуспендируют в 0,8 М растворе сорбита из расчета 1 мл раствора на 1 мл исходной суспензии протопластов в растворе УРД, и из этой суспенэии делают разведения i:10000 и 1:100000 (для разведений используют

0-8 M раствор сорбита). Аликвоты разведенной суспензии протопластов (по

0,2 мл) переносят в пробирки, содержащие 10 мл расплавленной агаризованной регенерационной среды следующего состава, г/л: дрожжевая азотная основа Дифко 6,7; глюкоза 20; сорбит 146, агар 20. Для предотвращения застывания агариэованной среды пробирки до использования выдерживают в водяной бане при 43-45 С. После легкого перемешивания содержимое пробирок вылива" ют в чашки Петри (диаметр 100 мм) и о помещают в термостат на 30 . На 2-3-и сутки в толще и на поверхности arapa наблюдают выросшие колонии регенерантов.

В табл. l представлены сравнительные данные по регенерации протопластов дрожжей Saccharomaces cerevisiae

LL 20, обработанных в течение 1 часа в среде УРД 2,6-дитретбутил-4-метилфенолом в различных концентрациях.

Пример 2. Протопласты дрожжей Saccharomyces cerevisiae GRF 18 получают и обрабатывают, как в примере 1.

Данные представлены в табл. 2 (обработка 2,6-дитретбутил-4-метилфено лом проводилась в течение 2 ч).

Формула изобретения

Способ получения регенерантов протопластов дрожжей Saccharomyces cerev1s1ае, предусматривающий внесение протопластов в регенерационную среду с последующим их выдерживанием в ней

3 !395674 до образования регенерантов, о т — бируют в течение 0,5-3 ч в питательл и ч а ю шийся тем, что, с це- ной среде YND, в которую дополнительлью увеличения выхода регенерантов, но вводят антиоксидант в виде 2,6-дипротопласты перед внесением в регене- третбутил-4-метилфенола в концентрарационную среду предварительно инку- ции 2-5 мкг/мл.

Т аблица 1

Условия экспари- Количество промента, концент- топластов в рация антиокси- l мл исходной данта суспензии

Выход протопластов

Количество ре % от числа генерантов из исходных мл исходной протоплассуспензии тов

Контроль (без обработки) 3,7 х !О

3,7 х !О

3,7 х 10

5,3 х 10

3,2,х 10

3,7 х 10

6,4х 10

2 мкг/мл

5 мкг/мл

20 мкг/мл

100

3 7 х 10

4

3а 100% .принято количество протопластов в 1 мл исходной суспензии.

Таблица 2

Ф

Выход протопластов

Количество протопластов в

1 мл исходной суспензии

Условия эксперимента, концентрация антиоксиданта

Количество ре генерантов as

1 мп исходной суспензии

% от числа исходных протопластов

Контроль (без обработки}

1,8 х 10

1,8х10

1„8х 10

5,5 х 10

1,6 х 10

1 4 х 10

1,0х 10

3,8 х 10 1 7х10

0 5 мкг/мл

2 мкг/мл

1,8х10

5 мкг/мл

10 мкг/мл

20 мкг/мл

l Sx10

1.8 х 10

Ф

За 100% принято количество протопластов в 1 мл исходной суспензии.

ВНИИПИ Заказ 2468/27 Тирюк 520

Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, r. Ултород, ул. Проектная, 4