Способ отделения полирибосомных информосом от свободных

 

Изобретение относится к молекулярно& биологии, биохимии и предназначено для изучения регуляции биосинтеза белка в клетках зукариотичесхих организмов. Цель изобретения - повышение чистоты целевых продуктов. Для . этого проводят диссоциацию полир1|бО сом известными агентами. Препарат цитоплазматических рибонуклеопротеидов инкубируюткС твердым иммуносорбентом. Жидкую фазу со свободными информосомами отделяют от твердой колоночной хроматографией или центрифугированием , затем проводят твердофазную диссоциацию полирибосом известными агентами . Необходим избыток твь-рдого иммуносорбента для связывания,. Источники цитоплазматических информосом (клетки, ткани, органы) инкубируют с радиоактивнь1м предшественником информосом 20-30 мин. 3 шт. с S

1

СОЮЗ СОНЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН . (191 (111

",(51}5 С 12 М 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К A ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

С4

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (46} 15, 12. 90. Бюл. У 46 (21) 4051531/28-14 (22) 11,03,86 (71) Институт .молекулярной биологии и биохимии AH КазССР (72) Х.И.Дощанов, М.А.Айтхожин .и З,Г.Айташева . (53) 612.015(088.&) (56) Спирин А.С., Гаврилова Л.П.,Ри" босома, М. 1971, с. 51-63. (54) СПОСОБ ОТДЕЛЕНИЯ ПОЛИРИБОСОМНЫХ ИНФОРМОСОМ ОТ СВОБОДНЬ1Х (57) Изобретение относится к молекулярной биологии, биохимии и предназ-. начено дпя изучения регуляции биосинтеза белка в клетках зукариотических, организмов. Дель изобретения - ловышение чистоты целевых продуктов. Для этого проводят диссоциацию полирибосом известными агентами. Препарат ци« топлазматических рибонуклеопротеидов инкубнруют.с твердым иммуносорбентом.

Жидкую фазу со свободными информосомами отделяют от твердой колоночной хроматографией илн центрифугированием, затем проводят твердофазную диссоцнацию полирибосом известными агентами. Необходим избыток твердого иммуносорбента дня связывания. Источники цитоплазматических информосом (клетки, ткани, органы) инкубируют с радиоактивным предшественником ннформосом 20-30 мин, 3 ил.

1412305

Изобретение относится к молекулярной биологии к биохимии и может быть использовано для изучения регуляции биосннтеэа белка в клетках зукариоти5 ческих организмов.

Цель изобретения — повьппение чисто ты целевых продуктов.

Поставленная цель достигается с помощью диссоциации полирибосом, свя- fp эанных с твердым иммуносорбентом для рибосом (тнердофаэной диссоциацией полнрибосом), известными агентами.

Препарат цитоплазматическкх рибонуклеопротеидон инкубируют с твердым иммуносорбентом. При этом полирибосомы, рибосомы и их субчастицы, присутствующие в препараты, связывают- ся с ним. Жидкую фазу, содержащую свободные информосомы, отделяют от тнердой колоночной хроматографией или центрнфугиронанием, после чего проводят твердофаэную диссоциацию полирибосом известными агентами. Полирибосомные ннформосомы, освободившиеся 25 от полирибосом в процессе диссоциации их ка рибосомные субчастицы, переходят в жидкую фазу. Те рибосомкые ,субчастицы, которые образовались в результате диссоциации полирибосом и рибосом и до этого не были непосредственно связаны с иммуносорбентом в составе рибосомы, тоже переходят в жидкую. фазу.и,загрязняют освободив шиеся полирибосомкые информосомы. Поэтому необходим избыток твердого им35 муносорбента для их связывания, который устананливается опытным путем.

Жидкую фазу с освободившимися полирибосомными информосомами отделяют от

40 твердой колокочной хроматографией или центрифугированием.

Источники цитоплазматических информосом (клетки, ткани, органы, целые организмы) инкубируют с радио активным предшественником информосом в течение 20-30 мик.

Пример 1. Отделение полирибосомных информосом от свободных из листьев гороха.

Получение цитоплазматических рибонуклеопротеидов.

l0 г зеленых листьев гомогенизируют.s буфере, содержащем 200 мИ Трис рН 8,5, 150 мМ КС1, 5 мИ MgCl<,,5 мИ

2-меркаптозтанола, 250 мИ сахароэы и

5 мкгlмл циклогексимида. Объем буфе- ра 20 мг. Гомогенат фильтруют через два слоя нейлона и жидкость центрифугируют при ЗООО g н течение 5 мин.

Надосадочную жидкость фильтруют и центрифугируют при 23000 ц в течение

20 мин в роторе Ф 50.!. Надосадочную жидкость обрабатывают Тритоном Х-100 (0,5/) н течение 10 мик и центрифугируют при 105000 g в течение 4 ч в роторе SW 50.1. Для мечекия in vitro осадок цитоплазматических рибонуклеопротеидов суспендируют в буфере, содержащем 50 мМ НЕРЕБ, рН 7,8, 10 мИ

KCl, 10 мМ М8С1, 5 мМ дитиотрейтола, 5 мкг/мп циклогексимида, 0,25 мМ фенилметилсульфонилфлюорида, 0,025 мИ лейпептина, 15 ед. РНКаэина. Агрегаты удаляют центрифугиронанием при

15000.g в течение 15 мин. 1-5 4. ед. рибонуклеопротеидов . инкубируют со смесью, содержащей 12 ед. Т4 РНК-лизагы и 100 икКи 3, 5 (5 -- э Р) цитидиндифосфата, приготовленной на буфере для суспенднронания. Объем смеси 30 мкл. Реакцию мечения проводят при +28 C и течение 30 мин. Для остановки реакции смесь охлаждают до +2 С. и разбавляют в 10 раз буфером для суспендирования без РНКазина и подвергают иммуноаффинной хроматографии.

Выделение цитоплаэматических рибосом для иммунизации кроликов.

10 r зеленых листьев гомогенизировали в 20 мл буфера, содержащего

200 ьИ Трис, рН 7,3, 150 мМ КС1, 5 мИ MgC1, 5 мИ ИЭТ. Гомогенат, фильтруют через два слоя нейлона и цент- . рифугируют при 3000 g в течение

5 мин, Надосадочную жидкость центрифугируют при 23000 g в течение 20 мин в роторе БИ27. После удаления липидного слоя.кадосадочную жидкость сливают и обрабатывают Тритоном Х-ll00 до конечной концентрации 0,57-в течение 10 мин. Наслаивают íà 1 М сахароэу, приготовленную на буфере для гомогенизацки, и центрифугировали при 105000 g s течение 1,5 ч в роторе SW 50.1. Осадок суспекдиронали в буфере, содержащем 50 мМ Трис, рН

7,4, 250 мМ NaC1 5 мМ MgC1, 1 мМ

ИЭТ. После удаления агрегатов центри;фугированием 50-75 А<<< ед. рибосом наносят на градиент концентрации сахароэы 15-30Å, приготовленный на буфере для суспендирования, и цектрифугируют при 100000 g в течение

195,мин в роторе SW27. Градиенты фракционируют по 1,3 мл и после измерения А ы но фракциях отбирают ки14!23 ковые фракции монорибосом, разбавляют буфером рля суспендирования с 20 мМ NaC1 вместо 250 иМ NaC1 в два раза. Разбавленные фракции замораживают при -75 C до иммунизации. Иммунизация кроликов. 1 мг рибосом смешинают с равным объемом полного адъюванта Фрейнда и несколько. Раз пропус» кают через иглу шприца. Препарат 1р вводят в объеме 0,5-1 мл внутримьппечно в оба бедра и под обе лопатки.

Инъекции антигена повторяют еженедельно в течение I мес. без адъюнанта в те же точки. Через 1 нед. после 15 последней инъекции берут кровь краевой вены уха и определяют наличие антител по двойной иммунодиффузии по

Ухтерлони. После месячного перерыва цикл повторяют с 0 5 мг рибосом. 3а 20 неделю перед каждым взятием крови проводят подстегивающие инъекции антигена, Приготовление иммуносорбента.

Протеин А-сефарозу CL 4В (" Фариа- 25 ция" Швеция) замачивают и отмывают согласно инструкции фирмы, затем промывают буфером, содержащим 20 мМ K-.

Na-фосфат, РН 7,6, 140 мМ NaCI

2,5 ил протеин А-сефарозы насыщают

lgG выделенным из иммунной сыворотки по А.Novotny.Basis Exercises in

Immunochemistry. А I,aboratory Manual.

Berlin Heidelberg .New Jork, 1979, р, 1-19, либо к этому количеству про- З5 теин А-сефарозы добавляют 4мл иммунной сыворотки. В обоих случаях инкубацию антител с носителем проводят в течение 30-60 мин в колонке из по» липропипена (наконечник С 6000, 6 к1,25 см, Пипетман фирмы "Жи сон") с фильтром из распущенного мираклоза на дне. Дпя удаления несвязавшихся белков колонку промывают выше приведенным буфером (фосфатным) до тех 45 пор, пока поглощение элюата при

280 нм не снизится до постоянного уровня. Затем колонку промывают буфером, содержащим 20 мМ ТЭА, рН 7,6, 25 иМ КСl, 5 мМ MgClg 1 ьИ МЭТ, - 5О

Процедура иммуноаффинной хроматографии.

Из раэбанленной в 10 раэ реакцион» ной смеси общим объемом .300 икл (ме- ченый пРепаРат цитоплазматических ри 55 бонуклеопротеидон) берут аликвоту н

20 мкл и фиксируют формальдегидои до конечной концентрации 4Х в течение

24 ч дпя анализа в градиенте плотнос05

4. ти СэС1, а также две аликвоты 5 и

10 мкл для измерения радиоактивности.

Оставшуюся часть. доводят до объема

I,5 мл ТЭЛ вЂ . буфером, которым промывают колонку. Буфер из колонки отсасывают и вносят 1,5 мл препарата (5

А ед., 2-5 10 имп./мин). Инкубацня продолжается в течение 30-60 мин при +2 С. -Затеи отсасывают фракции элюата по 1,5 мл до снижения радиоактивности до постоянного уровня (для измерения радиоактивности берут апикноты из каждой фракции злюата),. добавляя после отсасывания столько же ТЭА-буфера. Таким образом отделяют свободные информосомы. Фракции элюатов со свободными информосомами фиксируют 4Х-ным- формальдегидои для анализа s градиенте плотности CsCl.

Дпя получения полирибосомных информосом, из колонки отсасывали предыдущий буфер и вносили столько.же буфера, содержащего 90 мМ К, Na-фосфата, 0,5 иМ MgClg, мМ КС1, РН 7,6.

Связанные с иммуносорбентом полирибосомы инкубируют с этим же буфером в течение 30-60 мйн при +2 С (твердофазная диссоциация). Элюцню фосфат-. ным.буфером. проводят путем отсасывания, как описано вьппе . Для анализа в градиенте плотности CsC1 порции фосфатного элюата обязательно диализуют против буфера, содержащего

20 мМ ТЭА, РН 7,6, 26 мМ КС1, 5 мМ

MgCl<, l мМ МЭТ и 4 формальдегида . (перед диалиэом во фракции фосфатного элюата добанляют формальдегид до конечной концентрации 4Х).

Полученные результаты идентичны результатам, полученным на зародышах пшеницы (см. пример 2).

Пример 2. Фракцию 71 6 кроличьих антител или антисывЬротку к рибосомам эародьппей пшеницы инкубируют с протеин А — Сефароэой Cl-4 (Фармация, Швеция) согласно инструкции фирмы. Для элюции свободных информосом колонку.с иимуносорбентом промывают буфером, содержащим 20 иМ триэтаноламина, РН 7,6, 25 мМ КС1, 5 мМ MgClg и 5 мМ,2-меркаптоэтанола. В тои же буфере в колонку с иимуносорбентои вносят 10 А опт. ед. препарата цитоплазматических рибонуклеопротеидов из прорастанших в течение 12 ч и меченых 5- Н-уридинои зародышей пшеницы, Такое количество рибонуклеопротеидон достаточно для создания иеобхо 1412305 димого избытка с 2,5 мл иммуносорбента при титре антнсыворотки более

500, определенному с помощью двойной иммунодифузии по Ухтерлони. Инкубацию рибонуклеопротендов с иммуносорбентом проводят при 2-3 С s течение о

l ч при периодическом помешивании.

Затем отсасывают порции по 1-2 мл до снижения радиоактивности до постоянного уровня, добавляя при этом в коI лонку столько же этого буфера. Дпя получения полирибосомных информосом колонку с иммуносорбентом затеи переводят в 90 мМ К, Na-фосфатный буфер, рН 7,6, при соотношении l мл фосфатнога буфера на мп влажного иммуносорбента.- так, чтобы диссоциировать полирибосомы в течение 0,5-1,0 ч.

Элюцию полирибосомйых информосом проводят фосфатным буфером также,как .описано выше, до снижения радиоактивности до постоянного уровня, Для анализа в градиенте плотности СзС1 порции элюата диализуют против триэтаноламинового буфера. В качестве твердого носителя используют протеин — А - Сефарозу Сl-4В (" Фармация", Швеция).

Главной характеристикой цитоплазматических информосом является значение их плавучей плотности в гради" агенте CsC1, равное 1,40-1,47 г/см .

Фиг, 1 дает представление о характере элюции свободных (а ) и полирибосомных (б1 информосом (на этой и последующих фиг. прерывистая линиярадиоактивность, имп./мин; сплошная линия — поглощение при 260 нм (А ), 260 линия, прерывающаяся крестиками— плотность (p), г/см, по оси абсцисс — порции элюата, мгг„или фракции граднеггта плотности ",sC1. Видно, что основная масса свободных информосом (фиг. 2) элюируется в первых трех порциях, затем их количество снижается до постоянного уровня. Ксли в это время провести твердофаэную диссоциацию полирибосом, то величина радиоактивности снова повышается почти до первоначального уровня; что свидетельствует об освобождении из полирибосом каких-то PHK-связывающих структур. Анализ в градиенте плотности -CsC1 этих структур показывает, что они являются информосомами (фиг.3).

Как видно из фиг. 2 и 3, информосомы не загрязнены рнбосомным материалом, обнаруживающимся по поглощению при

20 260 нм в зоне плотностей 1,521,56 г/см .

Формула изобретения

25 Способ отделения полнрибосомных информосом от. свободньгх путем аффинной хроматографии, включающий диссоцнацню полирибосом, ннкубацию в буферном растворе и элюцию целевых продуктов, отличающийся тем, что, с целью повышения чистоты целевых продуктов, перед диссоциацией.проводят инкубацню с нммуносорбентом для рибосом до полного связывания

35 риб гсомного материала затеи отделяУ ют свободные информосомы иэ жидкой фазы, проводят твердофазную диссоциацию связанных полирибосом смесью

90 мМ -Na-фосфатного буфера с 0,5 мИ

40 хлорнда магния и 1 мМ хлорида калия, рН 7,6 при 0-4 С.

1412305

7Я

Составитель О.Агуреев

Редактор Т.Шагова Техред Л.Олийнык

Корректор В.Гирняк

Заказ 4335

Тираж 492- Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1!3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4