Способ получения моноклональных антител к легким @ -цепям иммуноглобулинов человека

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУВ ЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ HOMHTET СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (2) ) 4148920/28-13; 4) 47991/28-) 3 (22) 18.1).86 (46) )5.08.88. Бюл. У 30 (71) Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР (72) Е.Л.Арсеньева, P.Т.Богачева, А.P.Èáðàãèìoâ, Н.IO.Ëàáàçèíà, А.Г.Тоневицкий и О.В.Рохлин (53) 578.085.23(088.8) (56) Lowe J., Hardie D., Jef eriв R.

et al J. Immunol, 1981 v.42, р.649-659. (54) СПОСОБ ГОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫл

АНТИТЕЛ К ЛЕГКИМ 9, -ЦЕПЯМ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к о бласти биотехнологии и может быть использовано для диагностики аутоиммунных за болеваний человека. 1)елью изобретения является повьш ение чистоты целевого.„SU„» 1416509 А1

gI) 4 С 12 N 5/00, А 61 K 39/395 продукта. Способ осуществляется путем использования штаммов гибридных клеток IG5G7 или 5B4D6-1 ° Штаммы получают гибридизацией спленоцитов селезенки мышей BALE/С, иммунизированных препаратом легких % цепей человека, с клетками миеломы Х63 Ag8-653. Штаммы !

С5С7 и 5B4D6-1 хранятся в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номерами

ВСКК (П) У 75D и ВСКК (П) N73D соответственно. Секреция моноклональных антител на 3-4-й день культивирования составляет 15-20 мкг/мл культуральной среды и 5 мг/мл асцитической с жидкости. При культивировании клеток штаммов IG5G7 и 5B4D6-1 получают моноклональные антитела повышенной чистоты, специфически взаимодействующие с легкими 9, -цепями человека. 1 табл.

1416509

Изобретение относится к биотехно- логии и может быть использовано для диагностики аутоиммунных заболеваний человека, 5

Целью изобретения является повышение чистоты целевого продукта.

Для осуществления способа используют штамм гибридных клеток IG5G7 или 5В4116-I. 10

Штамм IG5G7 получают следующим образом.

Мышей линии HALH /с иммунизируют внутрибрюшинным введением 100 мкг легких -цепей человека, выделенных 1." из мочи (белки Бенс-Джонса), в 0,5 мл физиологического раствора, забуференного фосфатами (ЗФР), 5 мм Na-фосфатный буфер, рН 7,2-7,4, 150 мМ МаС1, без адъюванта. Иммунизацию повторяют 20 через 40 дней, вводя внутрибрюшинно

100 мкг легких Ъ -цепей (препарат

LAHT) в ЗФР без адъюванта. Через три дня после этого 1О клеток селезенки иммунных мышей гибридизи- 25 руют с 6-10 клеток миеломы мыши ч

Х63-А88-653 с помощью 0,4 мл 4,5%ного раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) мол,массы ?000, содержащего 10% диметилсульфоксида, в течение 1 мин. 30

После гибридизации и отмывки клеток от ПЗГа, клетки высевают в 96-луноч5 ные панели по 2 10 клеток в лунку.

Для культивирования и селекции гибридов используют среду ВУМ1-1640 с до35 бавлением 10Х лошадиной и 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 10 М

1 гипоксантина, 4 10 M аминоптерина и содержащую 4 10 клеток селезенки.

После двух клонирований практически 40

100% субклонов продуцируют антитела к легким -цепям человека. Наиболее продуктивныи штамм выводят в массовую культуру и обозначают IG5G7.

Штамм IG5G7 хранится в Специализи- „ рованной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии. АН СССР под номером

ВСКК (П 753 и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки.

Среда культивирования: среда RPNI1640 с добавлением 10Х телячьей эмбриональной сыворотки, 4 мМ глютамина, 100 мгк/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,05 мМ иеркаптоэта55 иола при 37 С в атмосфере 5Х углекислоты. Для выращивания штамма используют пластиковую посуду; посевная доза 100 тыс. кл/мл, клетки пассируют один раз в 3-4 дня, кратность рассева I:10, культура суспензионная.

Для выращивания асцита пригодны мыши BALB/с. Мышам за 7-30 дней до инъекции клеток штамма вводят внутрибрюшиннс по 0,5 мл пристана. Клетки инъецируют внутрибрюшинно по 25 10 кл/мл среды Игла. Асцит форми6 руется через 12-14 дней.

Продуктивность штамма.

Секреция моноклональных антител (МА) на 3-4-й день культивирования составляет 15-20 мкг/мл культуральной среды и 5 мг/мл асцитической жидкости при определении методом торможения радиоиммуноадсорбции. К моменту депонирования штамм прошел более 20 пассажей in vitro. Продукция МА сохраняется как минимум до 20 пассажей

in vitro и до 3 пассажей в асцитной форме.

Характеристика полезного продукта.

МА относятся к классу 18GI.OHè специфически взаимодействуют с легкими

7-цепями иммуноглобулинов человека.

Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микроплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК и по характеру включения тимидиновой метки. Криоконсервирование.

Для длительного хранения клетки штамма замораживают в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10% диметилсульфоксида. Режим замораживания: 4 С/мин до +4 С, затем l С/мин о до -40 С. После замораживания клетки переносят в жидкий азот. Размораживао ние проводят на водяной бане при 37 С.

Жизнеспособность клеток после размораживания 70-80% по окрашиванию трипановым синим.

Штамм 5В4Р6-I получают следующим образом.

Мышей линии BALB/ñ иммунизируют внутрибрюшинным введением 100 мкг легких h -цепей человека, выделенных из мочи (белки Бенс-Джонса), в

0,5 мл физиологического раствора, забуференного фосфатами, 5 мМ Na-фосфатный буфер, рН 7,2-7,4, !50 мМ НаС1, без адъюванта. Иммунизацию повторяют через 40 дней, вводя внутрибрюшинно

100 мкг легких g -цепей (препарат

IAVD) в ЗФР без адъюванта. Через три

--8 дня после этого 1 ° 10 ° клеток селезен1416509 ки иммунных мьппей гибридизируют с

6 ° 10 клеток миеломы мьппи Х63-Ag8-653 т с помощью 0,4 мл 457-ного раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) мол.массы

2000, содержащего 107, диметилсульфоксида, в течение 1 мин. После гибридизации и отмывки клеток от ПЭГа клетки высевают в 96-луночные панели по 2«

«10 клеток в лунку. Для культивиро вания и селекции гибридов используют среду RPMI-1640 с добавлением 107 лошадиной и 107 телячьей эмбриональной сыворотки, 10 М гипоксантина, 4 10 М аминоптерина и 1,6 10 М ти" мидина. Гибриды-продуценты клонируют

2 раза методом конечных разведений, высевая по 1 клетке в лунку, содержаФ щую 4 ° 1 0 кле ток селезенки. После двух клонирований практически 1007

I субклонов продуцируют антитела к легким Я -цепям человека. Наиболее про» дуктивный клон выводят в массовую культуру и обозначают 5B4D6"I.

Штамм 5B4D6-I хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии AH СССР под номером

ВСКК (П) 73D и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки.

Среда культивирования: среда RPMI1640 с добавлением 10Х телячьей эмбриональной сыворотки, 4 мМ Ь-глутами» на, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,05 мМ о меркаптоэтанола при 37 С в атмосфере

57 углекислоты. Для выращивания штамма используют пластиковую посуду, посевная доза 100 тыс. кл/мл; клетки пассируит 1 раз в 3-4 дня, кратность рассева l:10, культура суспензионная.

Для выращивания ясцита пригодны мьппи BALB/с. Мьппам за 7-30 дней до инъекции клеток штамма вводят внут рибрюшинно по 0,5 мл пристана. Клетки инъецируют внутрибрюшинно по 2-5

«10 кл/мл среды Игла. Асцит формиру6 ется через 12-14 дней.

Продуктивность штамма.

Секреция моноклональных антител на

3"4-й день культивирования составляет

15-20 мкг/мл культуральной среды и

5 мг/мл асцитической жидкости при определении методом торможения радио иммуноадсорбции. К моменту депонирования штамм прошел более 20 пассажей

in vitxo. Продукция MA сохраняется

25 как минимум до 20 пассажей in vitxn и до 3 пассажей в асцитиой форме.

Характеристика полезного продукта.

MA относятся к классу IBGI. Они специфически взаимодействуют с легкими % -цепями иммуноглобулинов человека. Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды, Заражение микроплазмой не выявлено при окрашивании красителями ня ДНК и по характеру включения тимидиновой метки. Крноконсервирование. Для длительного хранения клетки штамма замораживяют в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10Х диметилсульфоксида. Режим заморажива ния: 4 С/мин до +4 С, затем 1 С/миндо -40 С. После замораживания клетки переносят в жидкий азот. Размораживание проводят на водяной бане при 37 С.

Жизнеспособность клеток после размораживания 70-807 по окрашиванию трипановым синим.

Пример. Гибридные клетки

ILTBMMoB 1С5(:7 и 5В406-I помещают в г пластиковые флаконы площадью 25 см по 5 10 клеток в 5 мл среды RPMI1640 с 1ОХ эмбриональной телячьей сывороткой, 4 мМ глютамина,100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,05 мМ меркаптоэтянола. Клетки культивируют 2-3 дня при 37 С в атмосфере 57. СО . Полученные супернатанты используют в качестве реагентов в иммунохимических реакциях (как препараты МА).

На полистирольные 96-ячеечные па нели для микротитровяния сорбируют антиген — 2 мкг на ячейку в 100 мкл

ЗФР при 4 С в течение ночи. После насьпцения панелей 0,05Х-ным раствором

Твин-20 в ЗФР для уменьшения неспеци фического связывания антител с пластиком в ячейки вносят по 100 мкл, культуральной среды штамма 1G5G7 и о инкубируют 1 ч при 20 С. После этого

50 панель отмывают три раза по 250 мкл

ЗФР с 0 05Х-ным Твин-20 и вносят кроличьи антимьппиные антитела, меченые I (препарат с удельной активностью 0,8 ° 10 срм на мкг, 0,2«

«10 срм на ячейку в 100 мкл ЗФР с

0 05Х-ным Твин-20). После инкубации в течение 1 ч при 20 С панель трижды промывают ЗФР с 0,05 -ным Твин-20 .и просчитывают на счетчике.

1416509 6

Результаты исследований представ- Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я лены в таблице (цифры в таблице приведены за вычетом фона неспецифичес- Способ получения моноклональных кой сорбции, определяемой по сорбции антител к легким % -цепям иммуногло5 меченных антител после инкубации антиге- булинов человека путем выращивания на с нормальными иммуноглобулинами мыши. гибридомы в питательной среде с поРезультаты, представленные в таб» следующим выделением и очисткой целелице, свидетельствуют о высокой спе- вого продукта, о т л и ч а ю щ и йцифичности полученных МА по отношению 10 с я тем, что, с целью повьппения чиск легким Ъ -цепям иммуноглобулинов тоты целевого продукта, в качестве человека. Повьппение чистоты монокло- гибридомы используют штамм гибридных нальных ан ти тел до с тиг а е тс я тем, культивируемых клеток животных Мин. что для получения гибридов использу- musculus ВСКК (П) К 75D или штамм ют непродуцирующую иммуноглобулины 15 гибридных культивируемых клеток жимиеломную линию Х63-Ag 8-653. вотных Mus.musculus ВСКК (П) N 73D.

Антигены человек льная среда а МРС-П, с рм уль туральая среда тамма

84D6-I

Культура ная сред тамма .G5G7, с

800

20000 30Р

13000 450

18000 350

500 300

7500

IgG норм

IgGI БЕЛ

Т8СТ ДОЛ

IgMk БОБ

IgN Mauch

Ig АПс

Ig A2k

L ЛУК

ВОЛ

1300

14200

15700

1250

350

100

НО

НО

НО

9500 450

500

9000

10000 200

500

7900

1300 300

1000 150

L „P0D

500

250

300

РОЗ

350

Качественные данные получены методом FZISA с применением конъюгата пероксидазы с кроличьими антимышиными антителами

Составитель М.Серова

Редактор Т.Лазоренко Техред Л.Сердюкова Корректор В.Романенко

Заказ 4034/23 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва„ Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г„ Ужгород, ул. Проектная, 4