Способ получения первичной культуры гепатоцитов рыб

 

Изобретение относится к области культивирования клеток, а именно к получению первичной культуры гепатоцитов рыб. Целью .изобретения является упрощение способа получения гепатоцитов рыб и уменьшение трудоемкости процесса. Способ осуществляют путем введения живой рыбе хелатора-динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты в виде 250 мМ водного раствора из расчета 25 мкл/мл объема тела рыбы комбинированно путем внутрибрюшинной и внутримьшечной инъекции. После обесцвечивания кожных покровов печень изолируют, измельчают и встряхивают в физиологическом растворе. Полученную суспензию очищают от соединительной ткани и форменных элементов крови.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (П I (б1) 4 С 12 N 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ASTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4107426/31-13 (22) 23.07.86 .(46) 15.05.88. Бюл. В 18 (71) Институт биологии моря Дальне восточного научного центра АН СССР (72) В.В. Матвеев (53) 578.085.23(088.8} (56) Гулак П.В., Дудченко А.М., Зайцев В.В. и др. Гепатоцит. Функционально-метаболические свойства. М.:

Наука, 1985. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНЩ ПЕРВИЧНОЙ КУЛЬТУРЫ ГЕПАТОЦИТОВ РЫБ (57) Изобретение относится к области культивирования клеток, а именно к получению первичной культуры гепатоцитов рыб. Целью .изобретения является упрощение способа получения гепатоцитов рыб и уменьшение трудоемкости процесса. Способ осуществляют путем введения живой рыбе хелатора-динат-, риевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты в виде 250 мМ водного раствора из расчета 25 мкл/мп объема тела рыбы комбинированно путем внутрибрюшинной и внутримьппечной инъекции.

После обесцвечивания кожных покровов печень изолируют, измельчают и встряхивают в физиологическом растворе.

Полученную суспензию очищают от соединительной ткани и форменных элементов крови.

1396162

Изобретение относится к культивированию или сохранению животных клеток, а именно к способам получения первичной культуры гепатоцитов рыб, и может быть использовано в биотехнологии, медицине, а также в научноисследовательской работе для получения исходного материала для культуры клеток. i0

Цель изобретения — упрощение способа получения гепатоцитов и уменьшение трудоемкости процесса.

Указанная цель достигается тем> что в качестве хелатора используют 15 динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (синонимы: трилон

Б, ЭДТА Na ) в виде водного раствора в концентрации 250 мМ. Хелатор вводят из расчета 25 мкл 250 мМ раст- 20 вора трилона Б на 1 мл объема тела рыбы комбинированно путем инъекции (внутрибрюшинно и внутримышечно) в живой организм объекта. После обесцвечивания кожных покровов печень изолируют, измель>zàþò скальпелем, измельченную массу переносят в физиологический раствор и встряхивают, Полученную суспензию очищают от соединительной ткани и форменных элемен- 30 тов крови.

Способ осуществляют следующим образом.

Рассчитывают,цоэу хепатора из рас-, чета 25 мкл 250 мМ раствора трилона

Б на каждый миллилитр объема тела рыбы. Эту дозу вводят комбинированно . одну половину внутримышечно (в спинную мъшщу) >, ppyr þ половину — внутрибрюшинно в живой организм объекта.

После инъекции рыбу снова помещают в аквариум и производят визуальное наблюдение за изменением пигментной окраски кожного покрова. Через 1г

2 мин начинается обесцвечивание пиг- 45 ментов кожи, максимум которого наблюдается через 7-10 мин. Этот момент является наиболее благоприятным для полной гепатэктомии (изоляции печени иэ организма). Изолированную печень помещают на чашку Петри> механически измельчают скальпелем и переносят в физиологический раствор, который вручную или на шейкере встряхивакт в течение 1-2 мин, Кусочки печени почти полностью распадаются при этом на отдельные клетки„ Оставшиеся тяжи соединительной ткани удаляют, пропуская (фильтруя) взвесь через мельничный газ. Полученную суспензию гепатоцитов 3-4 раза промывают физиологическим раствором. Отделение клеток ю печени от избытка хелатора и форменных элементов крови производят с помощью гравитационного осаждения (т.е. отстаиванием в .олодильнике) в течение 25-30 мин, За это время форменные элементы крови не успевают осесть на дно сосуда и поэтому удаляются вместе с надосадочной жидкостью.

Затем производят оценку жизнеспособности полученных гепатоцитов.

Пример. В качестве объекта для получения гепа!оцитов берут бычка-керчака, объем гела которого равен l350 мп. Рассчитав дозу, комбинированно вводят 34 мл 250 мМ раствора трилона Б. Для этого рассчитанное количество раствора трилона Б набирают в шприц на 50 мл, чтобы вместилась сразу вся рассчитанная доза (это дает минимальную затрату времени на введение всей дрзы), После комбинированного введения дозы хелатора (внутримьпчечно и внутрибрюшинно) рыбу снова помещают в аквариум. Через

8 мин наступает максимальное обесцвечивание кожных покровов. Рыбу быстро вынимают иэ аквариума, вскрывают брюшную полость, удаляют печень и помещают ее в чашку Петри. Измельчают скальпелем и помещают кусочки в физиологический раствор.

Содержимое встряхивают вручную или на шейкере в течение 1-2 мин, Полученную суспензию пропускают через мельничный газ (фильтруют) и оставляют в холодильнике на 25 мин. По истечении этого времени надосадочную жидкость сливают, а к осадку добавляют новую порцию физиологического раствора, в 5 раз большую по объему, чем объем осадка, и снова отстаивают суспензию в течение того же времени.

Эту процедуру повторяют 3 раза до полного удаления форменных элементов крови (микроскопический контроль).

Жизнеспособность гепатоцитов определяют пробой с трипановым синим. В данном случае жизнеспособны 97Х клеток.

Формула из обретения

Способ получения первичной культуры гепатоцитов рыб путем обработки печени хелатором, ее изолирования, 1396162

Составитель В. Адамушкин

Техред N.Дидык Корректор В. Гирняк

Редактор Н, Швыдкая

Заказ 2497/51

Тираж 520

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная,. 4 измельчения, промывки измельченной массы в физиологическом растворе и очистки гепатоцитов, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью упрощения способа и уменьшения трудоемкости процесса, хелатор вводят комбиниэованно путем внутримышечной и внутрибрюшинной инъекции в живой организм рыбы в виде 250 мМ водного раствора динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты из расчета 25 мкл раствора на 1 мл объема тела рыбы, а после обесцвечивания кожного покрова печень изолируют.