Способ получения моноклональных антител к легким @ -цепям иммуноглобулинов человека

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики аутоиммунных заболеваний человека. Целью изобретения является повышение чистоты целевого продукта путем использования в качестве источника моноклонапьных антител (МКА) штамьюв гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ЗД5Е4 или 6Е7Д7. Штаммы ЗД5Е4 и 6Е7Д7 получают гибридизацией спленоцитов мышей BALB/C, иммунизированных легкими д&- цепями иммуноглобулинов человека, с клетками миеломы X63-Ag 8-653. Оба штамма культивируют на среде RPMI 1640 с добавлением 10% донорской телячьей сыворотки, пассируют один раз в 3-4 дня с кратностью рассева 1;10. Способ осуществляют, культивируя штаммы ЗД5Е4 и 6Е7Д7 в питательной сред е, выделяя целевой продукт и тестируя его на специфическое взаимодействие с. легкими ее-цепями иммуноглобулинов человека. Повышение чистоты целевого .продукта достигается использованием в качестве партнера для гибридизации при получении штаммов ЗД5Е4 и 6Е7Д7 . миеломы X63-Ag 8-653, не продуцирующей иммуноглобулинов или их легких цепей. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕа1УБЛИН

И9> (1П

SU, С 12 И 5/00, А 61 K 39/395

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А8ТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Ю

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЬГИЙ (21) 4148919/28-13 4148918/28-13 (22) 18.11.86 (46) 15.06.88. Бюл. У 22 (71) Всесоюзный кардиологический научный центр AMH СССР (72) Е,Л.Арсеньева, Т.Г.Богачева, А.P.Èáðàrèìoâ, Н.И.Лабазина, А,Г.Тоневицкий и О.В.Рохлин (,53) 578.085,23(088,8) ,(56) Lowe J., Найгiе D., Jefferis R. et. а1. — Т. Immunol, 1981, ч. 42, р. 649-659. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ

АНТИТЕЛ К ЛЕГКИМде-ЦЕПЯМ 1 ММУНОГЛОБУЛИНОВ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики аутоиммунных заболеваний человека. Целью изобретения является повышение чистоты целевого продукта путем использования в качестве источника моноклоиальных антител (ИКА) штаммов гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ЗД5Е4 или

6Е7Д7, Штаммы ЗД5Е4 и 6Е7Д7 получают гибридизацией спленоцитов мышей

BALB/ñ, иммунизированных легкими а8цепями иммуноглобулинов человека, с клетками миеломы Х63-Ag 8-653. Оба штамма культивируют на среде HPMI

1640 с добавлением 10% донорской телячьей сыворотки, пассируют один раз в 3-4 дня с кратностью рассева 1:10„

Способ осуществляют, культивируя штам. мы ЗД5Е4 и 6Е7Д7 в питательной среде, выделяя целевой продукт и тестируя его на специфическое взаимодействие с легкимиае-цепями иммуноглобулинов человека. Повышение чистоты целевого продукта достигается использованием в качестве партнера для гибридизации при получении штаммов ЗД5Е4 и 6Е7Д7 . 4 миеломы X63-Ag 8-653, не продуцирующей иммуиоглобулинов или их легких цепей. 1 табл.!

4026!7

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики аутоиммунных заболеваний человека, 5

Цель изобретения — повышение чистоты целевого продукта.

Способ заключается в том, что в . качестве источника моноклональных антител используют штамм гибридных щ0 культивируемых клеток животных Mus

musculus ЗД5Е4 или штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus

muscu1us 6Е7Д7.

Штамм ЗД5Е4 получают следующим .об- !5 разом.

Йьппей линии BALB/с иммунизируют внутрибрюшинным введением 100 мкг легкихэе-цепей человека, выделенных

20 из мочи в 0,5 мл физиологического раствора, забуференного фосфатами (ЗФР) (5 мМ Na-фосфатный буфер, рН

7,2-7,4, 150 мМ Na01 ) .без адъюванта.

: Иммунизацию повторяют через 40 дней,, вводя внутрибрюшинно 100 мкг легких

: -целей (препарат Lk) в ЗФР без адъюванта. Через 3 дня после этого 1 «

Я

«1О клеток селезенки иммунных мьппей гибридизуют с 6 ° 10 клеток миеломы т мьппи Х63-Ag 8-653 с помощью 0,4 мл

ЗО

457-ного раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) мол. массы 2000, содержащего

107 диметилсульфоксида, в течение

1 мин. После гибридизации и отмывки клеток от ПЭГа клетки высевайт в 96-луночные панели по 2 10 клеток, . .,в лунку. Для культивирования и селекции гибридов используют среду RPMI1640 с добавлением 107 лошадиной и

107, телячьей эмбриональной сыворотки, 4 ф т

10 М гипоксантина, 4 10 М аминопте-5 рина и 1,6 10 М тимидина.Гибриды-продуценты клонируют 2 раза методом койечиых разведений, высевая по 1 клетке в лунку, содержащую 4 !О клеток селезенки. После двух клонирований

Практически 1007. субклонов продуцируют антитела к легким,дп-цепям иммуно3лобулинов человека.

Наиболее продуктивный клон выводят

Ф массовую культуру и обозначают

ЗД5Е4. Штамм ЗД5Е4 хранится в специ ализированной коллекции перевиваемых соматических.клеток позвоночных Ин. ститута Цитологии AH СССР под номером

ВСКК(П) 72Д и характеризуется слеу рющими признаками.

Культуральные признаки.

Среда культивирования — среда

HPMI-1640 или ЖМЕМ с 107 донорской телячьей сыворотки, 4 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,05 ьИ меркаптоэтанола. Для выращивания штамма используют пластиковую посуду по5

« севная доза 10 Кл/мл, клетки выращивают при 37 С в атмосфере 57. СО пассируют один раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:10, Культура суспензионная.

Для выращивания асцита пригодны мыши BALB/ñ. Мьппам за 7-30 дней до инъекции клеток штамма вводят внутрибрюшинно 0,5 мл пристана, Клетки инъецируют внутрибрюшинно по 2-5 10 Кл/мл среды Игла. Асцит формируется через 12-14 дней.

Продуктивность штамма. Секреция моноклональных аитител (МКА) на 34 день культивирования составляет 10l5 мкг/мл культуральной среды и 35 мг/мл асцитической жидкости. Продукция антител сохраняется до 20 пассажей in vitro и 3 in vivo, Характеристика полезного продукта

МКА ЗД5Е4 относятся к I@M классу.Они специфически связываются с легкими ае-цепями иммуноглобулинов человека.

Контаминация.

Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК и по характеру включения тимидиновой метки.

Криоконсервирование.

Для длительного хранения клетки штамма замораживают в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 107. диметилсульфоксида. Режим замораживания . 4 С в минуту до 4 С, затем 1 С в минуту до -40 С. После замораживания клетки переносят в жидкий азот.

Размораживание — на водяной бане при

37 С. Жизнеспособность клеток после размораживания 70-807 по окрашиванию трипановым синим.

Штамм 6Е7Д7 получают следующим образом.

Мьппей линии BaLB/с иммунизируют внутрибрюшинным введением 100 мкг легких6п-цепей человека, выделенных из мочи в О,.й мл физиологического раствора, забуференного фосфатами (ЭФР) 1402617 ф » б фер рН 7 2 7 4 ция антител сохраняется до 20 пасса—

150 мИ БаС1), без адъюванта. Иммуни- жей in vitro и 3 in vivo. ,зацию повторяют через 40 дней, вводя Характеристика полезного продукта, внутрибрнппинно 100 мкг легкихге -цепей > MKA 6Е7Д7 относятся к I@61 классу. (препарат Ik) в ЗФР без адъюванта. Они специфически связываются с легкиЬ

Через 3 дня после этого 1 ° 10 клеток ми ое-цепями иммуноглобулинов человека. селезенки иммунных мышей гибриди- Контаминация. Бактерии и грибы в зуют с 6-10 клеток миеломы мыши

1 культуре не обнаружены при длительном

Х63-Ag 8-653 с помощью 0,4 мл 45 -но- 10 наблюдении и посевах на питательные го раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) среды. Заражение микоплазмой не вымол. массы 2000, содержащего 1ОХ ди- явлено при окрашивании красителями на метилсульфоксида, в течение l мин, ДНК и по характеру включения тимидиПосле гибридизации и отмывки от ПЭГа новой метки. клетки высевают в 96-луночные панели 15 Криоконсервирование. Для длительнопо 2.10 клеток в лунку. Для культиS го хранения клетки штамма замораживавирования и селекции гибридов исполь- ют в эмбриональной телячьей сыворотке зуют среду HPMI-1640 с добавлением с добавлением 10% диметилсульфоксида, 10 лошадиной и lOX телячьей эмбри- Режим замораживания: 4 С в минуту цо ф о 0 о ональной сыворотки, 10 M гипоксанти- 20 4 С, затем 1 С в минуту до -40 С, По-7 -5. на, 4" 10 И аминоптерина и 1,6 10 M сле замораживания клетки переносят тимидина. Гибриды-продуценты клониру- в жидкий азот. Размораживание — на ют 2 раза методом конечных разведений, водяной бане при 37 С. Жизнеспособвысевая по 1 клетке в лунку содержа- ность клеток после размораживания 70Ф

« щую 4 ° 10 клеток селезенки. После 25 80 по окрашиванию трипановыи синим. двух клонирований практически 100 . Пример. Гибридомные клетки посубклонов продуцируют антитела к лег- . мещают в пластиковый флакон площадью

5 .ким gB-цепям иммуноглобулинов челове- 25 кв.см по 5 10 клеток в 5 мл срека. Наиболее продуктивный клон выводят . ды BPYiI-1640 с lOX эмбриональной теляв массовую культуру и обозначают чьей сывороткой, 4 мМ глютамина, 6Е7Д7. Штамм 6Е7Д7 хранится в Специ- !00 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мп ализированной коллекции перевиваемых стрептомицина, 0,05 мИ.меркаптоэтаносоматических клеток позвоночных Инсти- ла, Клетки культивируют 2-3 дня при

О тута Цитологии АН СССР под номером . 37 С в атмосфере 4 . СО, Полученный

ВСКК(П) 71Д и характеризуется следу- 3> супернатант используют в качестве ющими признаками. реагента в иммунологических реакциях

Культуральные признаки. (как препарат MKA). MKA тестируют с

Среда культивирования — среда помощью радиоиммунного анализа, RPMI-1640 или DMKM с 10 донорской : На полистирольные 96-ячеечные па телячьеи сыворотки, 4 мМ 1глутами- 40 нели для микротитрования сорбируют на, 100 мкг/ил пенициллина, 100 мкг/мл антиген — 2 мкг на ячейку в 100 мкл стрептомицина, 0,05 Ж меркаптоэтано- ЗФР при 4 С в течение ночи. После нала. Для выращивания штамма использу- сьпцения панелей 0,05 -ным раствором ют пластиковую посуду посевная доза Твин-20 в ЗФР для уменьшения неспеци5 ь

10 Кл/мл, клетки выращивают при 37 С п5 фического связывания антител с пласт атмосфере 5 . СО, пассируют один тиком, в ячейки вносят по 100 мкл раз в 3-4 дня кратность рассева 1:IO. культуральной среды штаммов ЗД5Е4 и а

Культура суспензионная. Для выращива- 67ДЕ7 и инкубируют 1 ч при 20 С. По"ния асцита пригодны мыши BAL3/с. Мьь-,. сле этого панели отмывают три раза шам за 7-30 дней до инъекции клеток 0 по 250 мкл ЗФР с 0,05%-ным Твин-20 и штамма вводят внутрибрюшинно 0,5 ил <. вносят кроличьи антимьппиные антитела, с5 пристана. Клетки инъецируют внутрибрю- меченые Х по иетоду Бейля и др.

6 шинно по 2-5 10 кл/мл среды Игла, (препарат с удельной активностью

Асцит:фориируется через 12-14 дней. 1,1 10 срш на мкг, по 0,2«10 cpm

6 6

Продуктивность штамма, Секреция в 100 мкл ЗФР с 0,05%-ным Твин-20 на ионоклональных антител (МКА) на лунку для штамма 67ДЕ7 и с активно34 день культивирования составляет - стью 0,9 10 срш на мкг, по 0,2 «

15-20 мкг/мл культуральной среды и «1О cpm в 100 мкл ЗФР с 0,05 -ным

5 иг/мл асцитической жидкости. Продук- Твин-20 на лунку для штамма ЗД5Е4).

1402617 6 ,нию Х63 Ag8-653, не синтезирующую ж иммуноглобулинов или их легких цепей.

Формула из о бр ет ения

Культуральная среда штаммаЗД5Е4в срш

Культуральная среда штамма

6Е7Д7, срш

Антигены человек

Культуральная среда штамма

МЗС-!/, срш

1000 400 400,350

it BAA

ЬУРОД

1ЖГРИГ

500

500

650,200

14200 350,450, 10300

15000

16600

17500

?АР ОЗ

14000

15000

16800

lgG норм

Ig64 БРО(а) 20000

ll 7600

IgC!4 жЕЛ(ае) 18909

17200

IgX ВОН()

IgQ ЯКА

4900

В контроле окрашивания нет

Iga3 Не-.(е)

Хд04 Таг (е) IgM Веп(е)

IgZ(aa)

Ig A2(w) После инкубации в течение ч при

20 С панель, промывают ЗФР с 0,057.-нь

Твин-20 и просчитывают на счетчике, Результаты исследований представ5 лены в таблице (цифры приведены за

Вычетом сорбции меченых антител после

Инкубации антигена с нормальиыми имМуноглобулинами мыши).

Результаты, приведенные в таблице, свидетельствуют о том, что ЯКА ЗД5Е4 и 6Е7Д7 специфически взаимодействуют легкими%-цепями иммуноглобулинов человека. 15

Повышение их чистоты достигается за счет того, что в качестве партнеph для гибридизаЦии при получении ш таммов ЗД5Е4 и 6Е7Д7 используют лиСпособ получения моноклональных антител к легким у-цепям иммуноглобулинов человека, заключающийся в культивировании гибридомы в питательной среде с последующим выделением и очисткой целевого продукта, о т л и ч аю чц и и с я тем, что, с целью повышения чистоты целевого продукта, в качестве гибридомы используют штамм гибридных культивируемых клеток животных

Mus. musculus ВСКК(П)И?1П или штамм гибридных культивируемых клеток животных Nus. musculus ВСКК(П)Я?20, 400,500

550,350

350 650

500,300

400,300

500,450

1402617

11родолжение таблицы

Ig Al(ae)

Ig Al/а ге)

IgG3 HJl(w)

IgG4 жКЛ(Ю)

IgG4 БРО(Ж)

IgM. БОБ(Ф) Н.И

Н И

Н.И

Н.И .

"Качественные данные получены методом ELISA с применением конъюгата пероксидазы с кроличьими антнмыпиными . антителами.

Составитель М.Серова

Редактор Н.Киштулинец Техред A.Кравчук Корректор Л.Пилипенко

Заказ 37l1 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета .СССР по делам изобретений и открытий .

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 ° е

Производственно-йолиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4