Штамм гидридных культивируемых клеток животных mus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к дифференцировочному антигену в-лимфоцитов человека

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики гемобластозов человека. Целью изобретения является получение пугамма гибридных культивируемых клеток животных Миз musculus, .продуцирующего моноклональные антитела (МКА) .к диффер.енцировочному антигену В-лимфоцитов человека. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей BALB/c, иммунизированных клетками линии Daudi с клетками миеломы РЗ-ХбЗ-Ag 8.653. Штамм культивируют на среде RPMI-1640 с 10% донорской телячьей сыворотки, посевная доза 100 тыс. кл/мл, клетки пассируют один раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:10, культура суспензионная . Продукция МКА на 3-4 день культивирования in vitro составляет 15-20 мкг/мл культуральной среды и 7,8 мг/мл асцитической жидкости. МКА- относятся к классу IgG3 и выявляют дифференцировочный антиген В - лимфоцитов человека, зкспрессированньй. на различных стадиях дифференцировки - от незрелых В - клеток до плазмобластов. МКА используют для диагностики лимфоидных форм лейкозов и лимфом. 2 табл. 2 о со

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

k АВТОРСКОМУ С8ИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTHA (21) 4201376/31-13 (22) 25. 02. 87 (46) 30. 08. 88. Бюп. У 32 (71) Институт проблем онкологии им. Р.Е.Кавецкого (72) С.П.Сидоренко и E.Ï.Âåòðîâà (53) 578.085.23(088.8) (56) Wiels 1., Fellous М., Tursz Т.

Monoclonal antibody against à Burkitt

lymphoma associated antigen. — Pros.

Natl. Acad. Sci ОБА, 1981, 78, 10, 6485-6488. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

,КЛЕТОК EHBOTHbIX MUS МПБСШ.П8 ° ИСПОЛЬЗУЕМЫИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНОМУ АНТИГЕНУ В-ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики гемобластозов человека.

Целью изобретения является получение пвгамма гибрилных культивируемых клеток животных Mus musculus продуци(51)4 С 12 N 5/00р А 61 К 39/395 рующего моноклональные антитела (МКА) .к дифференцировочному антигену В-лимфоцитов человека. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей ВА1.В/с, иммунизированных клетками линии Daudi с клетками миеломы РЗ-Х63-Ag 8.653

Штамм культивируют на среде RPMI- 1640 с 10Х донорской телячьей сыворотки, посевная доза 100 тыс. кл/мл, клетки пассируют один pas в 3-4 дня, кратность рассева 1: l0 культура суспензионная. Продукция МКА на 3-4 день культивирования in vitro составляет

15-20 мкг/мл культуральной среды и

7,8 мг/мл асцитической жидкости. МКА. относятся к классу Х8СЗ и выявляют дифференцировочный антиген  — лимфоцитов человека, зкспрессированный на различных стадиях дифференцировки — от незрелых  — клеток до плазмобластов. МКА используют для диагностики лимфоидных форм лейкозов и лимфом. 2 табл.

1420020

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики гемобластозов человека.

Цель изобретения — получение штам5 ма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к дифференцировочному антигену  — лимфоцитов человека, экспрессированному на различных стадиях дифференцировки от незрелых В-клеток до плазмобластов.

Штамм получают следующим образом, Клетки селезенки иммунизированной мыши линии BALB (с гибридизуют с клетками мышиной миеломы РЗ-Х63-Ag1

8.653. Для иммунизации используют линию клеток Daudi полученную из ! лимфомы Беркитта. Мышь линии BALB/с 20 иммунизируют внутрибрюшинно по 8х х106 клеток 3 раза с интервалом

1 мес. и внутривенно 18х10 клеток.

Через 4 дня после внутривенного введения клеток проводят соматическую 25 гибридизацию с помощью 50%-ного полиэтиленгликоля м.м. 2000 клеток селезенки с клетками миеломы. Клетки разливают в 96-луночные пластиковые планшеты. Для культивирования гибрицных клеток на первых этапах используют среду MEM в модификации

Дальбекко с 15%-ной лошадиной сыво— ротки. После слияния в культуры клеток в течение двух недель добавляют

НАТ-среду (конечная концентрация ги35 поксантина 10 М, аминоптерина

4х10 М, тимидина 1,6x10 М, а затем в течение одной недели НТ-среду.

После селекции гибридов в НАТ- и 40

НТ-средах рост клонов гибридом выявляют в 107 из 192 лунок. Скрининг специфической антительной активности проводят методом иммунофлуоресценции в непрямом варианте на монослое живых клеток. Клетки прикрепляют на предметные стекла, обработанные раствором поли= L-лизина (100 мкг/мл, м.м. 40000-80000). При иммунофлуоресцентном анализе супернатантов гибридом специфическую антительную актив50 ность обнаруживают в 22 лунках, а при клонировании способность синтезировать антитела к клеткам Daudi сохраняют 9 клонов гибридом. Клонирование . методом лимитирующих разведений проводят 2 раза с использованием перитонеальных макрофагов мышей ВА1В/с в качестве фидера. После реклонирования и пассирования in vitro отбирают

1 клон гибридомы А7, клетки которого активно продуцируют антитела к поверхностным антигенам клеток линии

Daudi.

Штамм А7 хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института

Цитологии АН СССР под номером ВСКК(П)

¹ 77Д и характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

По цитоморфологическим признакам клетки мьппиной гибридомы штамма А7 преимущественно похожи на лимфоциты. среднего размера типа бластных клеток, с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением, выраженной базофилией цитоплазмы. В цитоплазме клеток не обнаружена активность фермента пероксидазы, активность кислой фосфа,тазы слабо-диффузная, а умеренная гранулярная реакция на неспецифическую а-нафтилацетатэстеразу сохраня-! ется при действии ингибитора NaF.

Культуральные признаки.

Среда культивирования — среда

RPMI-1640 с 10%-ной донорской телячьей сыворотки, 4 мМ Ь-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина при 37 С и в атмосфере 5% СО . Для выращивания штага а используют пластиковую или стеклянную посуду, посевная доза—

100 тыс. кл/мл, клетки пассируют один раз в 3-4 дня, кратность рассева — 1:10. Культура суспензионная.

Для выращивания асцита используют мышей линии BALB/ñ. Мьппам за 7ЗО дней до инъекции клеток штамма вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл приI стана. Клетки иньецируют внутрибрюшинно по 2 — 5x10 клеток в 5 мл сре6 цы Игла. Асцит формируется через

12-14 дней.

Продуктивность штамма.

Секреция МКА на 3 — 4 день культиви! роВаННН 1п Y1t1o составляет 1520 мкг/мл культуральной среды и

7,8 мг/мл асцитической жидкости.Продукция МКА сохраняется до 20 пассажей in vitro и до 3-х пассажей in viva

Характеристика полезного продукта.

MKA относится к классу IgG3. Они выявляют дифференцировочный антиген

В -лимфоцитов человека, экспрессированный на различных стадиях дифференцировки — от незрелых  — клеток до плазмобластов, 1420020

Таблица 1, Число положительных клеток, 7

Линии клеток

В-клеточные линии

RPMI-1788

10,0

20,0

PHS

Daudi

95,0

82,0

Namalva

Raj i

Ramo а, 27,0

Т-клеточные линии

Molt-4

2p CCRF-HSB2

Jurkat

Исследуемый матери

f 1,5-29,4

100

25,0-40,3

100

32,0-65 0

48,4-100

Контаминация.

При длительном наблюдении и посевах на питательные среды бактерии и грибы в культуте не обнаружены.

Криоконсервирование.

Для длительного хранения клетки штамма замораживают в эмбриональной телячей сыворотке с добавлением

10Х-ного диметилсульфоксида. Режим замораживания: 4 С в минуту до +4 С,,затем 1 С в минуту до -70 С. После замораживания клетки переносят в жидкий азот. Размораживание — на водяной бане при 37 С. Жизнеспособность клеток после размораживания — 70-80Х по окрашиванию трипановым синим, Использование штамма А7 иллюстрируется следующим примером.

Пример. 0 05 мл тестируемык антител в соответствующем разведении наносят на клетки-мишени (20 мин при

37ОС), прикрепленные на предметные стекла, покрытые поли- L-лизином, Далее, отмывают клетки культуральной средой от избытка антител, инкубиру-. ют в течение 20 мин при 37 С с кроо личьей сывороткой, меченой FITC вновь отмывают клетки, высушивают препараты на воздухе и заключают в

50Х-ный глицерин. Препараты исследу.ют в люминесцентном микроскопе в отраженном свете при возбуждении люминесценции синефиолетовыми лучами (максимум пропускания В = 400 нм). Взаимодействие МКА А-7 с клетками различнык линий (число положительных клеток,Ж) представлено в табл. 1.

Клетки здоровых людей мононуклеары периферической крови гранулоциты крови клетки костного мозга стромальные фибробласты костного мозга

Клетки миндалин детей при хроническом тонзиллите

Клетки крови больнык хроническим лимфолейкозом

Ни-Т, ни В-клеточная линия

25 К вЂ” 562. Результаты, представленные в табл. 1, свидетельствуют о том, что

MKA А-7 являются В-специфическими, gp т.е. взаимодействуют с мембранными антигенами В-клеточных линий, (sa исключением линии Ramos5 не реагируя с Т-клеточными линиями и К-562, Взаимодействие МКА А-7 с клетками

З5 крови в норме и при злокачественных лимфопролиферативных заболеваниях приведено в табл. 2.

Таблица 2

1420020 6

Продолжение табл. 2 острым лимфобластным лейкозом

20, 0-60, 0

4, 0-10, 0 миеломной болезнью

Клетки лимфатических узлов больных лимфогранулематозом

80 18у 0-92,0

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток, животных Mus musculus ВСКК (II) N - 77Д, используемый для получения моноклональных антител к дифференцировочному антигену В-лимфоцитов человека.

Составитель M. Серова

Редактор И. Сегляник Техред А. Кравчук Корректор M.Демчик

Заказ 4290/25 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 475

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4

Результаты, представленные в табл. 2, свидетельствуют о том, что в периферической крови здоровых людей от 11,5 до 29,.4Х клеток взаимодействуют с МКА А-7. В костном мозге здоро вых.людей до 40,3Х клеток несут этот антиген. В то же время гранулоциты ! периферической крови и стромальные фибробласты костного мозга дают отрицательную реакцию. Только до 3„5Х

1 ,тимоцитов реагирует с МКА А-7. При инфекционном мононуклеоэе в периферической крови число клеток, реагирующих с МКА, составляет около 5Х.

В абсолютном большинст е случаев в !

Миндалинах при хроническом тонэиллите детей число В-клеток, реагирующих с МКА А-7, составляет от 32 до 65Х

Клетки, несущие антиген, выявляемый МКА А-7, обнаруживаются при зло качественных лимфопролиферативных заболеваниях, однако не во всех слу-! чаях. Так, клетки с этим антигеном присутствуют при хроническом лимфолей,козе в 70Х случаев, при лимфогранулематозе — в 80Х случаев, а при остром лимфобластном лейкозе у детей .— только в 20Х случаев. При миеломной болезни единичные клетки несут этот антиген.

Таким образом, полученные МКА А-7 взаимодействуют с дифференцировочным антигеном В-клеток человека, и могут быть использованы для диагностики лимфоидных форм лейкоэов и лимфом.