Способ получения декапептидов или их фармацевтически приемлемых солей

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

09) (И) !!3 „

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н flATEHTY

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3597664/23-04 (62) 2929801/23-04 (22) 30.05,83 (23) 10,06,80 (31) 4? 661 (32) 11.06.79 (33) US (46) 30.09.88. Бюл. У 36 (71) Синтекс (И.С.А.), Инк, (VS) (72) Джон Джозеф Нестор, Гордон Генри

Джонс и Брайан Генри Викери (US) (53) 547.964.4.07(088.8) (56) Шредер Э. и Любке К. Пептиды.

М.: Мир, 1967, ч. Е, с, 116, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕКАПЕПТИДОВ ИЛИ

ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ПРИЕМЛЕМЫХ СОЛЕЙ (57) Изобретение касается пептидов, в частности получения декапептидов (5)) 4 С 07 К 7/06 А 61 К 37 02 общей ф-лы (пиро) Glu-His-Ткр-Sei-Tyr-3- 2-нафтил)-В-А1а-Leu-Arg-Pro-Z, где Z=Aza-Gly-NH< нли Gly — NH<, или их фармацевтически приемлемых солей, обладающих гормональными свойствами, что может быть использовано в медицине. Цель изобретения — создание новых более активных пептидов.

Их синтез ведут реакцией присоединения двух пентапептидов, имеющих разные фрагменты соединения указанной ф-лы в необходимой последовательности. Целевой продукт выделяют в свободном виде или в виде соли. При необходимости целевой продукт очищают с помощью жидкостной хроматографии.

Новые полипептиды в 1 5-2 раза активнее известного при зффективной дозе

0,04 и 0,06 мкг/кг и токсичности

Ы)во= 40 мк/кг.

1428205

Изобретение относится к способу получения декапептидов или их фармацевтически приемлемых солей — новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в медицине.

Дель изобретения — получение новых декапептидов, обладающих более высокой активностью как агонисты 1.Н-РН.

Пример 1, 160 мг Вос-d-nal (2)-Leu-Arp-Pro-Glу-NH< растворяют в 3 мл трифторуксусной кислоты в .40-миллиметровой трубке для центри::фугирования (d-nal(2) — .(2-нафтил) -D-А1а-). Гомогенный раствор обрабатывают 35 мл абсолютного эфира и центрифугнруют полученный в результате осадок. Декантируют всплывающий слой и.псвторно суспендируют оса- 20 док в 40 мп эфира, а затем повторно центрифугируют. Полученный в результате всплывающий слой декантируют, тщательно сушат осадок, полученный в трубке для центрифугирования, делая 25 это в вакууме., получая при этом лишенный защитных групп на С-окончании пентапептид в виде белого порошка.

Затем 162 мг (0,24 ммоль, 207.-ный избыток) Руго-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-ÎÍ и 65 мг (0,48 ммоль, 1007-ный избыток) бенэотриаэола растворяют в 3 мл редистиллированного диметилформамида (ДМФ) в трубке для центрифугирования емкостью 40 мл, и после охлаждения раствора льдом добавляют 54 мг .. (О, 24 ммоль) N,N -дициклогексилкарбодиимида. К этой смеси добавляют лишенный защитных групп пентапептид, полученный по описанной методике, в растворе 3 мл ДМФ, содержащем 30 мкл (0,27 ммоль) п — метилморфолина, после чего реакцию осуществляют в течение а

48 ч при 4 С. Исследование аналитическими методами обратной фазы в ходе жидкостной хроматографии при высоком давлении подтверждает факт полного завершения реакции, Реакционную смесь отфильтровывают и концентрируют в вакууме до получения масла, которое отбирают в 7 мл

0,0005 ш NH4, ацетат при рН 7 очищают путем пропускания через карбоксиметил сефадексную колонну (2,5 х

100 см), используемую в фармакологии, и эллюируют при градиенте от 0,005 55 до 0,49m NH4 ацетатным буфером при рН 7. Выходящий из колонны поток контролируют по УФ-поглощению при длине волны 280 нм, и фракции, соответствующие главному пику последнего выходящего раствора, анализируют аналитически с помощью жидкостной хроматографии при высоком давлении. Содержащие продукт фракции охлаждают и лиофилиэируют до получения 210 мг продукта, соответствующего PGlu-His-Trp-Ser-Tyr-d-па1(2)-Leu-Ar8-Pro-С1у-NН т в виде белого порошка, PnLg

=-66 (С,НоАс).

Продукт можно подвергнуть дальнейшей очистке посредством применения жидкостной хроматографии при высоком давлении к препаративной обратной фазе с использованием колонны С-!8 (30 мкм, 2,5 х 100 см, Lichroprep гу e. merc<) путем элюирования раствором, содержащим 40Õ СН СИ, 60Х воды 0,3 М аммоний ацетат, при рН 4,5.

Пример 2. 160 мг Вос-d-nal (2)-Leu-Arg-Pro-Gly-ИН растворяют в 3 мл трифторуксусной кислоты в трубке для центрифугирования емкс стью 40 мл. Снятие защитных групп и обработку осуществляют по примеру 1.

После этого 157 мг (О, 22 ммоль, 10процентный избыток (пиро) Glu-His-Тгр-Бег-Tyr-N

Раствор перемешивают в течение 10мин о при температуре -25 С, а затем добавляют О, 165 мл (1, 5 ммоль) п-метилморфолина (до получения (рН 7,5), К этой смеси добавляют раствор лишенного защитных групп пентапептида, полученного по указанной методике, и 4 мл ДМФ, содержащего 30 мкл п-метилморфолина.

Затем рН раствора изменяют до 7,5 и проводят реакцию в течение 3 ч при о температуре -20 С а затем в течение о

48 ч при температуре 4 С. Анализ на базе жидкостной хроматографии при высоком давлении подтвердил окончание реакции.

Реакционную смесь отфильтровыва- . ют и концентрируют до получения масла в вакууме, после этого чистят по- средством ионообменной.хроматографии

1428205 егистрируют процент самок, щих частичное подавление Способ получения декапептидов об- . только диэструс и про- щей формулы I (лиро) Glu-His-Тгр-Serне эструс), с 4-го дня 45 -Туг-3-(2-нафтил)-D- Ala-Leu-Arg-Ргоамок, показывающих полное кструса (т.е. только ди- rpe Z — Gly 1Н, Aza Gly NHz, -го дня. Величины ЕД вы- или их фармацевтически приемлемых зо прямой линии зависимости солей,отличающийсятем, данных подавления эстру- 5О что пентапептид, соответствующий од"1 алоги назначались в виде ному фрагменту соединения I вводят солей в физиологическом во взаимодействие с пентапептидом, воре, содержащем О, 17 . соответствующим другому фрагменту иьей сыворотки. Объем соединения I, в требуемой последоватавлял 0,2 мл и аналог 55 тельности и целевой продукт выделяал в дозе О, 05; 0, 1; 0, 2 ют в свободном виде или в виде фаРма

Контрольная группа (фи- Цевтически пРиемлемых солей.

ВНИИПИ Заказ 4870/59 Тираж 348 Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная» 4 на карбоксиметильной сефадексной колонне по примеру 1. Фракции собирают и лиофилизируют, получают 195 мг продукта, соответствующего рС1и-His-Trp-Ser-Tyr-d-паl(2)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH в виде беловатого порошка, (е j -62 (С,НоАс).

Полученный таким образом продукт подвергают дальнейшей очистке с ис- 1ð пользованием препаративной жидкостной хроматографии с обращенными фазами при высоком давлении с применением колонки С-18, как описано в примере 1.

Пример 3, В условиях примера 15

2 путем конденсации двух пятичленных фрагментов: (пиро) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-N и Н-3-(2-нафтил)0-А1а-Leu3

-Arg-Pro-Aza-Gly-NH получают дека2 пептид (пиро)С1п-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-нафтил)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Aza

Gly NH» который выделяют в свободном виде или в виде соли, (= -34,3 (C=0,34 АсОН).

Аминокислотный анализ: Ser 0,74(1),25

Glu 0,89(1), Pro 0,94(1), Leu 0,98(1), Tyr 1,00(1), His 1,03(1), Try 1,01(1), Arg 0,99(1), Nal (2), 1,08(1) NH>

1,13(1) .

Проведены биологические испытания 30 описываемых декапептидов, Самок крыс (Hilltop, Spragrie, Dauley приблизительно 220 г с открытыми влагалищами) взвешивают сгруппированными по 5 на клетку и 2 клетки на группу. Крыс инъецируют подкожно два раза в день (за исключением указанного ниже) в течение 14 дней.

Ежедневно берут мазки из влагалища для определения стадии цикла теч- 4р ки и регистрируют вес тела в О, 1 и

2 недели. P показываю течки (т.е, эструс, но и процент с подавление э эструс), с 3 водятся из процентных са. LHPH ан их ацетатных солевом раст альбумина бь инъекции сос присутствов или 0,4 мкг. зиологичеекий раствор, содержащий

BSA) не показывала никакого подавления эструса. Величины ЕД для объединенных групп с частичным и полным подавлением эструса составляют следующие:

Соединение: ЕД о мкг/инъекц. (пиро)-Глютамил- гистидил-триптофил-серил-тирозил-3-(2-нафтил)-Д-аланил-лейцил-аргинил-пролил-глицин-NH 0,04 (пиро) -Глютамин-гистидил-триптофил-серил-тирозил-3-(2-нафтил)-Д-аланил-лейцил-аргинил-пролил-asаглицин-NHz 0,06

Известное соединение

fd-Trpb -LHRH 0,08

Сопоставительный анализ показывает, что предлагаемые соединения в

1,5-2 раза активнее известного.

Определяют токсичнбсть описываемых соединений.

Шесть мышей Swiss-Webster (Сомонсен), каждая весом около 25 гр, инъецировались подкожно 0;25 мл водного раствора (3- (2-нафтил) -d-Ala) 6-L HRH в виде его ацетатной соли. -Доза

40 мг/кг или около 1 мг/мышь. Мышей наблюдали два раза в день на смертность в течение 21 дня. Летальных эффектов не наблюдалось. Величина

1,Д составляла, следовательно, более 40 мг/кг.

Формула изобретения